DNA芯片技�(shù)是指在固相支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷�探針,或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表�,然后與�(biāo)記的樣品雜交,通過�(duì)雜交信號(hào)的檢�(cè)分析即可得出樣品的遺傳信息(基因序列及表�(dá)的信息)。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物,所以稱為DNA芯片�
芯片的概念及�(fā)展歷� D NA 芯片 (又稱基因芯�、生物芯片) 技�(shù)是自 20 世紀(jì) 90 年代初發(fā)展起來的新興 技�(shù)� 是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針, 有規(guī)律地排列固定于支持物�� 然后與待�(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配�(duì)原理�(jìn)行雜交, 再通過激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)� CCD 成像掃描系統(tǒng)等對(duì)芯片�(jìn)行掃�,并配以�(jì)算機(jī)系統(tǒng)�(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出� 較和檢測(cè),從而迅速得出所要的信息。順�(yīng)上述�(fā)展要求的�(chǎn)�,它的出�(xiàn)為解決此類問� 提供了光輝的前景。該技�(shù)系利用芯片制造技�(shù),將大量 (通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高� 400� 探針分子固定于支持物�,再與標(biāo)記的樣品分子�(jìn)行雜�,通過檢測(cè)每�(gè)探針分子� 雜交信號(hào)�(qiáng)度�(jìn)而獲取樣品分子的�(shù)量和序列信息� 它可以對(duì)生命科學(xué)與醫(yī)�(xué)中的各種生物 化學(xué)反應(yīng)過程�(jìn)行集�,從而實(shí)�(xiàn)�(duì)基因、配體、抗原等生物活性物�(zhì)�(jìn)行高效快捷的�(cè)� 和分�。它的出�(xiàn)將給生命科學(xué)、醫(yī)�(xué)、化�(xué)、新藥開�(fā)、生物武器戰(zhàn)�(zhēng)、司法鑒�、食� 與環(huán)境監(jiān)督等眾多�(lǐng)域帶來巨大的革新甚至革命�
20 世紀(jì) 80 年代,Ba i ns 等人就曾將短� D NA 片斷固定到支持物上,借助雜交方式 �(jìn)行序列測(cè)�� DNA 芯片從實(shí)�(yàn)室走向產(chǎn)�(yè)化卻是直接得益于探針固相原位合成技�(shù)� � 照相平板印刷技�(shù)的有�(jī)�(jié)合以及激光共聚焦顯微技�(shù)的引入, 它使得合�� 固定高密度的 �(shù)以萬�(jì)的探針分子切�(shí)可行,而且借助激光共聚焦顯微掃描技�(shù)可以�(duì)雜交信號(hào)�(jìn)行實(shí) �(shí)� 靈敏� �(zhǔn)確的檢測(cè)和分�� 1996 �� f yme t r i x 公司成功研制出首批實(shí)� DNA � Af 片和芯片閱讀�,為 DNA 芯片�(chǎn)�(yè)開創(chuàng)了先�。DN A 芯片技�(shù)由于同時(shí)將大量探針固� 干支持物上, 所以可以一次性對(duì)樣品大量序列�(jìn)行檢�(cè)和分�� 從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡� � � Sou t he rnb l o t t i ng � No r t he r n b l o t t ing 等) 技�(shù)操作�(fù)�、自�(dòng)化程度低� 操作序列�(shù)量少、檢�(cè)效率低等不足。而且,通過�(shè)�(jì)不同的探針陣�、使用特定的分析� 法可使該技�(shù)具有多種不同的應(yīng)用價(jià)值,如基因表�(dá)譜測(cè)�、突變檢�(cè)、多�(tài)性分�、基� 組文庫作圖及雜交�(cè)序等�
根據(jù)DNA芯片的制備方式可以將其分為兩大類�
原位合成芯片(synthetic gene chip�
采用顯微光蝕刻等技�(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片稱為原位合成芯片。這種芯片的集成度教高,可�(dá)10萬~40萬點(diǎn)�/平方厘米。但合成的寡核苷酸探針長(zhǎng)度較短,一般為8�20�(gè)核苷酸殘基(nucleotide,nt),最�(zhǎng)�50nt,因此需要使用多�(gè)相互重疊的探針片�(jìn)行檢�(cè),才能對(duì)基因�(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定�
DNA微集芯片(DNA microchips�
將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片稱為DNA微集芯片,又稱為DNA微集陳列(DNA microarray�。這類芯片集成度相�(duì)較低,可�(dá)1萬~10萬點(diǎn)�/平方厘米,但使用的探針組的來源比較靈�,可以是合成的寡核苷酸短片段,也可以是采用來自基因組的較�(zhǎng)的DNA片段;可以是雙鏈,也可以采用單鏈的DNA或RNA片段,且技�(shù)�(shí)�(xiàn)未受到嚴(yán)格的專利控制,因而近年來�(fā)展很�。探針的�(zhǎng)度可�(dá)100�500nt�
一、芯片的制備
芯片制備的基本原理�
芯片的制備包括支持物的預(yù)處理、原位合成芯片的�(zhǔn)備和DNA微集陳列的制備三�(gè)方面�
1.支持物的�(yù)處理
目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分為兩類:�(shí)性材料和膜性材�。實(shí)性材料包括硅芯片、玻片和瓷片�。膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等。實(shí)性材料需要�(jìn)行預(yù)處理,使其表面衍生出羥基、氨基等活性基�(tuán)。在合成寡核苷酸前,這些基因可與光敏材料的光敏保�(hù)基團(tuán)形成共價(jià)交聯(lián)而被保護(hù)起來,合成時(shí)在光照下除去光敏保護(hù)基團(tuán),該活性基�(tuán)又可以和活化的單核苷酸發(fā)生化�(xué)反應(yīng)。另一方面,這些活性基�(tuán)可與DNA分子中的羥基等基�(tuán)形成共價(jià)�(jié)合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表�。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸等,使其帶上正電荷吸附帶負(fù)電荷的DNA探針�
2.原位合成芯片的制�
原位合成芯片是采用顯微光蝕刻(photolithography)技�(shù)或壓電打?。╬iezoelectric printing)技�(shù),在芯片的特定區(qū)域原位合成寡核苷酸而制成。顯微光蝕刻技�(shù)也稱為光引導(dǎo)聚合技�(shù)(light-directed synthesis�,它不僅可用于寡核苷酸的合成,也可用于合成寡肽分�。它是照相平板印刷技�(shù)(photolithography)與傳統(tǒng)的核酸,多肽固相合成技�(shù)相結(jié)合的�(chǎn)�,是原位合成芯片的主要方�。壓電打印法的裝置與普通的彩色噴墨打印�(jī)相似,所用的技�(shù)也是常規(guī)的固相合成方��
3.DNA微集陳列的制�
DNA微集陳列的制備采用的是預(yù)先合成DNA或制備基因探針然后打印到芯片上的方式�
�、樣品的�(zhǔn)�
樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和�(biāo)記等過程�
1.樣品的分離純化
主要從活組織或血液中獲得DNA或mRNA,這�(gè)過程包括�(xì)胞分離,破裂,去蛋白,提取及純化核酸的過��
2.樣品的�(kuò)�
�(cè)定時(shí)往往需要較多的樣品分子,因此對(duì)于分離獲得的基因組DNA通過PCR技�(shù)直接�(kuò)增,�(duì)于mRNA則需要逆轉(zhuǎn)�,制備cDNA�
3.樣品的標(biāo)�
�(biāo)記物主要有熒光分子(cy3、cy5�、生物素以及放射性同位素�。帶有標(biāo)記的dNTP(cy3或cy5-dNTP�32P-dNTP、生物素-dNTP)通過DNA或cDNA�(kuò)增的過程,摻入靶分子序列。也可以在制備引物時(shí),摻入標(biāo)記的核苷�,擴(kuò)增靶序列后,使擴(kuò)增產(chǎn)物末端帶有標(biāo)記物。膜性載體可以用于檢�(cè)同位素標(biāo)記的樣品�
樣品分子�(biāo)記的�(zhì)量影響芯片檢�(cè)的靈敏度,因此,核酸的提�,反�(zhuǎn)錄以及標(biāo)記等各環(huán)節(jié)要求�(yán)格操作。熒光標(biāo)記分辨率高于同位素標(biāo)�,而且可以采用雙色,如�(duì)照樣品標(biāo)紅色,待檢樣品標(biāo)綠色,有助于�(jié)果分析與判斷�
�、分子雜�
芯片雜交是應(yīng)用標(biāo)記的待測(cè)樣品(靶序列)與固定在載體表面的探針�(jìn)行的�(fù)雜過��
依據(jù)探針�(zhǎng)�、類型以及不同的目的,確定溫�、鹽濃度與反�(yīng)�(shí)間。通常采用的條件是�42��50%甲酰胺,6×SSC�0.5%SDS�5×Denhardt試劑。也可采�65��6×SSC�0.5%SDS�5×Denhardt試劑或�65��10%SDS�7%PEG-800�
雜交過程類似Northern或Southern雜交,如封閉液預(yù)雜交、雜�、清�、干燥與檢測(cè)�
�、檢�(cè)分析
芯片雜交信號(hào)的檢�(cè)可應(yīng)用熒光檢�(cè)�、質(zhì)譜法、化�(xué)�(fā)光法、光�(dǎo)纖維法以及生物傳感器�。其中激光共聚焦熒光檢測(cè)法是最常應(yīng)用的方法:激光從芯片的背面切入,聚焦于芯片與靶溶液的相互作用�,與探針雜交的靶序列�(biāo)記物被激�(fā)�(chǎn)生熒光,�(jīng)過棱鏡聚焦而被檢測(cè)器檢�(cè)。樣品靶序列與探針嚴(yán)格配�(duì)雜交的分子發(fā)生強(qiáng)熒光信號(hào),不完全雜交顯示較弱的信�(hào)�
核酸是由核苷�(nucleotide) 按一定次序連接而成的生物有�(jī)高分子。堿基可以分� 5 種堿�,分別為腺嘌�(adenine ,縮寫為 A) 、胸腺嘧� (thymine ,縮寫為 T) 、尿嘧啶 (uracil ,縮寫為 U) 、胞嘧啶 (cytosine ,縮寫為 C) 和鳥嘌呤(guanine ,縮寫為 G) 。兩 條核苷酸分子鏈能夠通過連續(xù)的堿基互�(bǔ)相結(jié)�� 而互�(bǔ)方式只能� A �(duì) T� A �(duì) U � C �(duì) G。最常提到的核酸分子� DNA( � A� T� C � G 序列�(gòu)�)� RNA( � A � U� C� G 序列�(gòu)�) ,其� DNA 分子就是通過這種堿基互補(bǔ)方式形成其穩(wěn)定的雙鏈� 旋結(jié)�(gòu)� DNA 分子鏈上的一些片段能夠以堿基互補(bǔ)的方式將其信息傳遞給 mRNA 分子 (稱為�(zhuǎn)�) ,然后通過 mRNA 合成出蛋白質(zhì)(稱為翻譯) ,這些片段被稱為基因。如果兩 �(gè)核酸分子的堿基序列不互補(bǔ),那么它們之間的配對(duì)�(jié)�(又稱為雜�)就不�(huì)�(fā)�。利用� 種高度的特異�,含有一�(gè)已知基因序列的核酸分�,可被視為一�(gè)分子探針 � 該探針� 過和生物樣品中與之互�(bǔ)的目�(biāo)核酸分子的雜交來檢測(cè)出相�(yīng)的基��
核酸芯片,又� DNA 芯片或基因芯片,就是把成千上萬�(gè)不同序列的核酸探針分� 以點(diǎn)陣的形式固定在芯片表�� 然后和經(jīng)過熒光標(biāo)記的樣品�(jìn)行雜交反�(yīng)� 在雜交后的清� 步驟�,沒有和探針�(jié)合上的核酸分子將被去除,而結(jié)合到探針上的目標(biāo)核酸分子,其熒光 �(biāo)記在特定波長(zhǎng)激光激�(fā)下會(huì)�(fā)出熒光信�(hào)� 其信�(hào)�(qiáng)度表征了樣品中被檢測(cè)到的目標(biāo)核酸 分子或基因的總量或濃�� 借助專門的熒光掃描設(shè)備得到的這樣一張各探針�(diǎn)亮度不相同的 雜交圖譜,經(jīng)過計(jì)算機(jī)軟件的處�,研究者可以一次獲得樣品中眾多基因的量化分析結(jié)�� 從而迅速地指導(dǎo)與基因有�(guān)的一系列研究�
DNA芯片使用的基本流程�
DNA芯片使用包括待測(cè)樣品�(zhǔn)�、分子雜交和檢測(cè)分析3�(gè)步驟�
1.待測(cè)樣品的準(zhǔn)�
樣品的準(zhǔn)備包括樣品的分離純化、擴(kuò)增和�(biāo)記�
首先采用常規(guī)方法從組織細(xì)胞中分離純化樣品核酸、DNA或mRNA,由于目前芯片檢�(cè)儀器的靈敏度有�,要求對(duì)樣品中靶序列�(jìn)行高效而特異地?cái)U(kuò)�。樣品的�(biāo)記主要采用熒光法,也可以用生物素,放射性核素標(biāo)記法�
2.分子雜交
待測(cè)樣品�(jīng)�(kuò)增和�(biāo)記處理后,即可與DNA芯片上的探針陳列�(jìn)行分子雜�。芯片雜交與傳統(tǒng)的Southern印跡等雜交方法類�,屬�-液雜交。探針分子固定于芯片表面,與位于液相的靶分子�(jìn)行反�(yīng)。芯片雜交的特點(diǎn)是探針的量顯著大于靶基因片段,雜交動(dòng)力學(xué)呈線形關(guān)�。雜交信�(hào)的強(qiáng)弱與樣品中靶基因的量成正相關(guān)�
3.檢測(cè)分析
芯片雜交及清洗后,未雜交分子被清除,帶有熒光�(biāo)記的靶DNA(雜交分子)與其互補(bǔ)的DNA探針形成雜交�,在激光的激�(fā)�,熒光素�(fā)射熒�。以掃描儀�(duì)熒光信號(hào)�(jìn)行檢�(cè)和分�,通過陳列上DNA探針的原始序列將靶DNA的信息反映出��
DNA芯片技�(shù)在醫(yī)�(xué)�(lǐng)域的�(yīng)�
DNA芯片用于基因診斷、DNA序列�(cè)�、臨床藥物篩選、法�(yī)鑒定� 食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)�(cè)等方�。在�(yī)�(xué)�(lǐng)域具有極大的潛力�
1.基因診斷
�(yīng)用DNA芯片技�(shù)可以在DNA水平檢測(cè)與疾病相�(guān)的內(nèi)源性或外源性基�;應(yīng)用表�(dá)芯片可以在mRNA水平分析同一組織在不同的�(fā)育階段,正常及病理狀�(tài)基因表達(dá)的差�,也可以分析不同組織同一基因在正常及病理狀�(tài)下表�(dá)的差異,從而為疾病診斷與分�,病原微生物分型提供科學(xué)依據(jù)�
2.DNA序列�(cè)�
任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解成一系列堿基�(shù)固定、錯(cuò)落而且重疊的寡核苷酸,如GTACTCGAATGC分解成GTACTAGA、TACTCGAA、ACTCGAAT、CTCGAATG、TCGAATGC五�(gè)�(cuò)�1�(gè)堿基但是可重�7�(gè)堿基�8體亞序列,當(dāng)然也可以分解�7��9體或其他整數(shù)(n體)亞序�。如果用某種方法�5�(gè)亞序列全部測(cè)定出�,就可以重新組建原來的核苷酸排列順序。應(yīng)用這一原理,可以合成或�(yīng)用已知序列的所有可能的n體寡核苷酸,并將其固定在芯片表面,然后與�(biāo)記的待測(cè)靶序列雜�,經(jīng)過重新組合,即可得到待測(cè)的DNA序列�
3.臨床藥物篩選
臨床許多�(xì)菌對(duì)藥物具有抗藥�,但是不同的亞型�(duì)同一藥物的敏感性不�。DNA芯片技�(shù)已被用于鑒定�(jié)核菌及非典型分支桿菌的基因型與耐利福平的相�(guān)性以及HIV�(chǎn)生抗藥性與其逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因突變的相�(guān)�。這為臨床選擇敏感藥物提供了有效手段�
4.其他�(lǐng)�
法醫(yī)鑒定、食品工�(yè)、環(huán)境監(jiān)�(cè)等方�,DNA芯片技�(shù)也將具有極大的潛力�