血球計�(shù)板被用以對人體內(nèi)�、白血球進行顯微計數(shù)之用,也常用于計算一些細菌、真�、酵母等微生物的�(shù)�,是一種常見的生物學工��
血球計�(shù)板(改良牛鮑計數(shù)板)
用厚玻璃制成。每塊計�(shù)板由H形凹槽分�2個同樣的計數(shù)池。計�(shù)池兩�(cè)各有一支持�,將特制的專用蓋玻片覆蓋其上,形成高0.10mm的計�(shù)池。計�(shù)池畫有長、寬�3.0mm的方�,分�9個大方格,每個大格面積為1.0毫米X1.0毫米=1.0平方毫米;容積�1.0平方毫米X0.1毫米=0.1立方毫米。其�,中央大方格用雙線分�25個中方格,位于正中及四角5個中方格是紅細胞計數(shù)區(qū)域(圖中淺紅色區(qū)域),每個中方格用單線劃分為16個小方格。四角的4個大方格是白細胞計數(shù)區(qū)域(圖中淺藍色區(qū)域),每個大方格用單線劃分為16個中方格。根椐標準局(NBS)規(guī)定,大方格每邊長度允許誤差為±1%�
說明:上圖紅色方框代表一個大方格;綠色方框代表一個中方格,兩種中方格的面積不一樣大;藍色方框代表一個小方格�
1.視待測菌懸液濃�,加無菌水適當稀釋(斜面一般稀�100倍),以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度�
2.取潔凈的血球計�(shù)板一�,在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片�
3.將菌懸液搖�,用滴管吸取少許,從計數(shù)板中間平臺兩�(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴(不宜過多),讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū),勿使氣泡產(chǎn)�,并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸�。也可以將菌懸液直接滴加在計�(shù)區(qū)上(不要使計�(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸�,以免加蓋蓋玻片�,造成計數(shù)區(qū)深度的升高),然后加蓋蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡)�
4.靜置片刻,使細胞沉降到計數(shù)板上,不再隨液體漂移。將血球計�(shù)板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩(wěn),先在低倍鏡下找到計�(shù)區(qū)�,再�(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細胞的折光率和水的折光率相�,觀察時應減弱光照的強度�
5.計�(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個中方格組成,按對角線方�,數(shù)左上、左�、右�、右下的4個中方格(即100小格)的菌數(shù)。如果是25個中方格組成的計�(shù)區(qū),除�(shù)上述四個中方格�,還需�(shù)中央1個中方格的菌�(shù)(即80個小格)。為了保證計�(shù)的準確�,避免重復計�(shù)和漏�,在計數(shù)�,對沉降在格線上的細胞的�(tǒng)計應有統(tǒng)一的規(guī)�。如菌體位于大方格的雙線�,計�(shù)時則�(shù)上線不數(shù)下線,數(shù)左線不數(shù)右線,以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細胞計入本�,本格的下線和右線上的細胞按�(guī)定計入相應的格中。見右圖:即本格中計�(shù)細胞�3��
6.對于出芽的酵母菌,芽體達到母細胞大小一半時,即可作為兩個菌體計�。每個樣品重復計�(shù)2-3次(每次�(shù)值不應相差過�,否則應重新操作�,按公式計算出每mL(g)菌懸液所含細胞數(shù)��
7.測�(shù)完畢,取下蓋玻片,用水將血球計�(shù)板沖洗干�,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免損壞�(wǎng)格刻�。洗凈后自行晾干或用吹風機吹�,放入盒�(nèi)保存�
血球計�(shù)板是一塊特制的厚型載玻�,載玻片上有四個槽構成三個平�。中間的平臺較寬,其中間又被一短橫槽分隔成兩半,每個半邊上面各刻有一小方格網(wǎng),每個方格網(wǎng)共分九個大方格,中央的一大方格作為計�(shù)�,稱為計�(shù)區(qū)。計�(shù)區(qū)的刻度有兩種:一種是計數(shù)區(qū)分為16個中方格(大方格用三線隔開),而每個中方格又分�25個小方格;另一種是一個計�(shù)區(qū)分成25個中方格(中方格之間用雙線分開),而每個中方格又分�16個小方格。但是不管計�(shù)區(qū)是哪一種構�,它們都有一個共同特�,即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。計�(shù)區(qū)邊長�1mm,則計數(shù)區(qū)的面積為lmm2,每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片�,計�(shù)區(qū)的高度為0.1mm,所以每個計�(shù)區(qū)的體積為0.1mm3,每個小方格的體積為1/4000mm3�
使用血球計�(shù)板計�(shù)�,先要測定每個小方格中微生物的數(shù)�,再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細胞的�(shù)��
紅細胞數(shù)/L=N*25/5*10*10^6*200
N為:五個中方格的RBC總數(shù)
N/5為:5個中方格(粉紅色區(qū)域)的平均RBC�(shù)量(然后推及至中央大方格中每一個中方格RBC的數(shù)量)
N*25/5為:中央大方格RBC總數(shù)(即�0.1mm(ul)的RBC總數(shù)�
N*25/5*10為:1mm(ul)RBC總數(shù)
N*25/5*10*10^6為:1L的RBC總數(shù)
*200為血液的稀釋倍數(shù)
公式簡化后:紅細胞數(shù)/L=N/100*10^12
公式前面部分都是換算成每微升血多少該計�(shù)細胞;后都是由微升換算到升,乘以10�6次方
(1)目鏡測微尺每格長�=兩個重疊刻度間物鏡測微尺格�(shù)×10/兩個重疊刻度間目鏡測微尺格�(shù)
(2)以同樣方�,分別在不同倍率的物鏡下測定測微尺上每格的實際長�.
(3)如此測定后的目鏡測微尺的尺度,僅適用于測定時所用的顯微鏡的目鏡和物鏡的放大倍數(shù).若更換物�,目鏡的放大倍數(shù)�,必須再進行校正標定.
以計�(shù)酵母菌為�
(1)用血球計�(shù)板計�(shù)酵母菌懸液的酵母菌個數(shù).
(2)樣品稀釋的目的是便于酵母菌懸液的計�(shù),以每小方格內(nèi)含有4-5個酵母細胞為�,一般稀�10倍即�.
(3)將血球計�(shù)板用擦鏡紙擦�,在中央的計數(shù)室上加蓋專用的厚玻片.
(4)將稀釋后的酵母菌懸液,用吸管吸取一滴置于蓋玻片的邊�,使菌液緩緩滲�,多余的菌液用吸水紙吸�,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球計�(shù)室內(nèi).
(5)計數(shù)�,如果使用16格�25格規(guī)格的計數(shù)�,要按對角線位,取左�,右上,左下,右下4個中�(�100個小�)的酵母菌�(shù).如果�(guī)格為25格�16格的計數(shù)�,除了取其4個對角方位外,還需再數(shù)中央的一個中�(�80個小方格)的酵母菌�(shù).
(6)當遇到位于大格線上的酵母�,一般只計數(shù)大方格的上方和右方線上的酵母細胞(或只計數(shù)下方和左方線上的酵母細胞).
(7)對每個樣品計�(shù)三次,取其平均�,按下列公式計算每1ml菌液中所含的酵母菌個數(shù).
3.計算公式
(1)16格�25格的血球計�(shù)板計算公�:
酵母細胞�(shù)/ml=100小格�(nèi)酵母細胞個數(shù)/100×400×10四次方×稀釋倍數(shù)
(2)25格x16格的血球計�(shù)板計算公�:
酵母細胞�(shù)/ml=80小格�(nèi)酵母細胞個數(shù)/80×400×10四次方×稀釋倍數(shù)
4.血球計�(shù)板的清潔
血球汁�(shù)板使用后,用自來水沖洗,切勿用硬物洗�,洗后自行晾干或用吹風機吹�,或用95%的乙�,無水乙醇,丙酮等有機溶劑脫水使其干�.通過鏡檢觀察每小格�(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀�.若不干凈,則必須重復清洗直到干凈為�.
血球計�(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成�.玻片中有四條下凹的槽,構成三個平�.中間的平臺較�,其中間又被一短橫槽隔為兩�,每半邊上�,刻有一個方格網(wǎng).方格�(wǎng)上刻�9個大方格,其中只有中間的一個大方格為計�(shù)�,供微生物計數(shù)�.這一大方格的長和寬各�1mm,深度�0.1mm,其體積為0.1mm3.
計數(shù)室通常有兩種規(guī)�.一種是大方格內(nèi)分為16中格,每一中格又分�25小格;另一種是大方格內(nèi)分為25中格,每一中格又分�16小格.但是不管計數(shù)室是哪一種構�;它們都有一個共同的特點,即每一大方格都是由16×25=25×16=400個小方格組成,見圖.
計算�(guī)�
血細胞計數(shù)的誤差分別來源于技術誤差和固有誤差。其中由于操作人員采血不順利,器材處理、使用不當,稀釋不準確,細胞識別錯誤等因素所造成的誤差屬技術誤差;而由于儀器(計數(shù)板、蓋�、吸管等)不夠準確與精密帶來的誤差稱儀器誤�,由于細胞分布不均勻等因素帶來的細胞計數(shù)誤差屬于分布誤差或計�(shù)域誤差(filederror�。儀器誤差和分布誤差�(tǒng)稱為固有誤差或系�(tǒng)誤差。技術誤差和儀器誤差可通過�(guī)范操�、提高熟練程度和校正儀器而避免或糾正,但細胞分布誤差卻難于徹底消除。因�,搞好紅細胞計數(shù)的質(zhì)量控制一般需采用以下措施�
1.避免技術誤�,糾正儀器誤�
�1)所用器材均應清潔干�,計�(shù)板、血蓋片、微量吸管及刻度吸管的規(guī)格應符合要求或經(jīng)過校�。①計數(shù)板的鑒定:要求計�(shù)室的臺面光滑、透明,劃線清晰,計數(shù)室劃線面積準�。必要時采用嚴格校正的目鏡測微計測量計數(shù)室的邊長與底面積,用微米千分尺測量計�(shù)室的深度。美國國家標準局(NBS)規(guī)定每個大方格邊長的誤差應小于1%,即1±0.01mm,深度誤差應小于2%,即0.1±0.002mm。若上述標準,應棄之不用。②血蓋片應具有一定的重量,平�、光滑、無裂痕,厚薄均勻一�,可使用卡尺多點測量(至少在9個點�,不均勻度在0.002mm之內(nèi)。必要時采用平面平行儀進行測量與評�,要求呈�(xiàn)密集平行的直線干涉條�。簡單的評價方法是將潔凈的蓋片緊貼于干燥的平面玻璃上,若能吸附一定的時間不脫落,落下時呈弧線形旋�(zhuǎn),表示蓋片平�、厚薄均勻。同�,合格的蓋片放置在計�(shù)室表面后,與支持柱緊密接觸的部位可見到彩�。出的蓋片與其他蓋片緊密重合�,在掠射光線下觀�,如見到完整平行的彩虹條紋表示另一枚蓋片質(zhì)量也符合要求。③目前臨床實驗室多采用一次性微量采血管采集毛細血管血,除注意定點購買使用信譽較好廠家的產(chǎn)品外,還應對每一批量的采血管進行抽樣檢查,可通過水銀稱重法或有色溶液比色法進行校正,誤差不應�1%�
�2)紅細胞稀釋液應等�、新鮮、無雜質(zhì)微粒�
�3)嚴格操�,從消毒、采血、稀�、充池到計數(shù)都應�(guī)范,尤其應注意的是血樣稀釋及充池時既要作到充分混�,又要防止劇烈震蕩為破壞紅細�。必須一次性充滿計�(shù)�,防止產(chǎn)生氣�,充入細胞懸液的量以不計�(shù)室臺面與血蓋片之間的矩形邊緣為��
�4)報告法定計量單��
2.縮小計�(shù)域誤差及分布誤差
縮小計數(shù)域誤差或分布誤差由于血細胞在充入計�(shù)室后呈隨機分布或稱Poisson分布(),而我們所能計�(shù)的細胞分布范圍是有限�,由此造成的計�(shù)誤差稱為計數(shù)域誤差或分布誤差。縮小這種誤差的有效方法就是盡量擴大細胞計�(shù)范圍和計�(shù)�(shù)�,一般行誤差估計,然后決定所需計數(shù)的數(shù)目和計數(shù)范圍,只要能將誤差控制在允許范圍�(nèi)即可。Berkson指出,當使用同一支吸管、同一面計�(shù)�,計�(shù)0.2mm2面積的細胞數(shù),有望將CV控制在可接受�7%以內(nèi)。對于紅細胞計數(shù)而言,由于紅細胞�(shù)量較多,在計�(shù)室中顯得比較“擁擠�,根�(jù)Poisson公式推斷。欲將誤差控制在變異百分�(shù)5%以內(nèi),至少需要在計數(shù)室中計數(shù)400個紅細胞,因此要求計�(shù)五個中方格的紅細胞。事實上Berkson還通過實驗證明,紅細胞的計�(shù)域誤差為s=0.92,較理論誤差(Poisson分布誤差)要小�
3.降低異常標本的干擾誤差
排除異常標本的干擾白細胞�(shù)量在正常范圍�,相對于紅細胞數(shù)量來�,其影響可忽�,但如白細胞過高�>100×109/L�,則應對計數(shù)�(jié)果進行校正。方法是:①實際RBC=計得RBC-WBC。如當紅細胞換算后為3.5×1012/L、白細胞換算后為100×109/L�,病人實際紅細胞�(shù)應為3.4×1012/L。②在高倍鏡下計�(shù)時,避開有核細胞。有核細胞體積比正常紅細胞大,中央無凹陷,無草黃色折�,可隱約見到細胞�。此�,當病人急性嚴重貧血時網(wǎng)織紅細胞可提前大量釋�,也給紅細胞計數(shù)帶來一定的干擾,而且影響�(wǎng)織紅細胞值計算結(jié)果。其校正方法有待探討�
血球計�(shù)板在顯微鏡下直接進行測定。它觀察在一定的容積中的微生物的個體�(shù)�,然后推算出含菌�(shù),簡便快�。但是在計數(shù)時包括死活細胞均被計算在�(nèi),還有微小雜物也被計算在�(nèi)。這樣得出�(jié)果往往偏高,因此適用于對形�(tài)個體較大的菌體或孢子進行計數(shù)�
維庫電子通,電子知識,一查百��
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