凝膠色譜技�(shù)是六十年代初�(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分析技�(shù),由于設(shè)備簡�、操作方�,不需要有機溶�,對高分子物�(zhì)有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜�。凝膠色譜主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。目前已�(jīng)被生物化�(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及�(yī)�(xué)等有�(guān)�(lǐng)域廣泛采�,不但應(yīng)用于科學(xué)實驗研究,而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)�
根據(jù)分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物,凝膠色譜又可分為凝膠過濾色譜(GFC)和凝膠滲透色譜(GPC��
凝膠過濾色譜
凝膠過濾色譜一般用于分離水溶性的大分子,
如多糖類化合�。凝膠的代表是葡萄糖系列,洗脫溶劑主要是水�
凝膠滲透色譜法
凝膠滲透色譜法主要用于有機溶劑中可溶的高聚�(聚苯乙烯、聚氯已�、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子�(zhì)量分布分析及分離,常用的凝膠為交�(lián)聚苯乙烯凝膠,洗脫溶劑為四氫呋喃等有機溶劑�
凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子�(zhì)量和相對分子�(zhì)量分�,同時根�(jù)所用凝膠填料不�,可分離油溶性和水溶性物�(zhì),分離相對分子質(zhì)量的范圍從幾百萬�100以下�
凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合�?;瘜W(xué)�(jié)�(gòu)不同但相對分子質(zhì)量相近的物質(zhì),不可能通過凝膠色譜法達到完全的分離純化的目��
一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流�(jīng)凝膠色譜柱時,各分子在柱�(nèi)同時進行著兩種不同的運動:垂直向下的移動和無定向的擴散運動。大分子物質(zhì)由于直徑較大,不易進入凝膠顆粒的微�,而只能分布顆粒之間,所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外,還可以進入凝膠顆粒的微孔中,即進入凝膠相內(nèi),在向下移動的過程中,從一個凝膠內(nèi)擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒,如此不斷地進入和擴散,小分子物�(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì),從而使樣品中分子大的先流出色譜�,中等分子的后流�,分子最小的流出,這種�(xiàn)象叫分子篩效�(yīng)。具有多孔的凝膠就是分子��
各種分子篩的孔隙大小分布有一定范�,有極限和最小極限。分子直徑比凝膠孔隙直徑大的,就會全部被排阻在凝膠顆粒之�,這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不�,也不能有分離效�。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進入凝膠孔隙,即使它們的大小有差�,也不會有好的分離效果。因�,一定的分子篩有它一定的使用范圍�
一是分子很�,能進入分子篩全部的�(nèi)孔隙;二是分子很�,完全不能進入凝膠的任何內(nèi)孔隙;三是分子大小適�,能進入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相�(yīng)的部�。大、中、小三類分子彼此間較易分�,但每種凝膠分離范圍之外的分�,在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不�,但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子,在凝膠床中的分布情況是不同的:分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙�(nèi),而分子較小的可進入較多的凝膠顆粒內(nèi),這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動距離較短,分子較小的移動距離較長。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床,這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另�,凝膠本身具有三維網(wǎng)狀�(jié)�(gòu),大的分子在通過這種�(wǎng)狀�(jié)�(gòu)上的孔隙時阻力較�,小分子通過時阻力較�。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時,按照分子量大小排隊,凝膠表�(xiàn)分子篩效�(yīng)�
聚丙烯酰胺凝�
聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝�,是以丙烯酰胺為單位,由甲叉雙丙烯酰胺交�(lián)成的,經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀,控制交�(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠。交�(lián)劑越多,孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-P(Bio-GelP�,由日本tosoh的TSKGEL的pw系列,適合蛋白和多糖的純�。即丙烯酰胺和少量交�(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺,在催化劑過硫酸銨作用下聚合形成凝膠�
聚丙烯酰胺簡稱PAM,分子量100�500�。聚丙烯酰胺主要有兩種商品形�,一種是粉末狀的,另一種是膠體,還有聚丙烯酰胺乳液(上海合成樹脂研究所研制)。易溶于冷水,速度很慢,高分子量的聚丙烯酰胺當(dāng)濃度超過10%以后.就會形成凝膠狀�(jié)�(gòu)。提高溫度可以稍微促進溶解,但溫度不得超�50�,以防發(fā)生分子降�。難溶于有機溶劑。溫度超�120℃時分解。中�,無毒。用作增稠劑、絮凝劑、減阻劑,具有凝�、沉降、補強等作用。貯存于陰涼、通風(fēng)、干燥的庫房�(nèi),防潮、避�、防�。存放時間不宜過��
交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex�
?、臩ephadexG交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex,不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示,G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10�。例如,G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5�,同樣G-200克每克千膠吸�20�。交�(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10,G-15,G-25,G-50,G-75,G-100,G-150,和G-200。因此,“G”反映凝膠的交聯(lián)程度,膨脹程度及分部范圍�
?、芐ephadexLH-20,是SephadexG-25的羧丙基衍生�,能溶于水及親脂溶劑,用于分離不溶于水的物質(zhì)�
瓊脂糖凝�
瓊脂糖Agarose,縮寫為AG,是瓊脂中不帶電荷的中性組成成份,也譯為瓊膠素或瓊膠糖。瓊膠糖化學(xué)�(jié)�(gòu)由�-D-吡喃半乳�(1-4)連接3,6-脫水α-L-吡喃半乳糖基單位�(gòu)��
把瓊脂糖,即幾乎不含硫酸根的主要成分為多糖的瓊脂,溶于熱�,冷卻制成的凝膠。制成的小顆粒用于凝膠過�。適于用sephadex不能分級分離的大分子的凝膠過�,若使用5%以下濃度的凝�,也能夠分級分離�(xì)胞顆粒、病毒等。利用其吸附性小的特�,有時用它代替瓊脂、以作為免疫電泳或凝膠內(nèi)沉降反應(yīng)的支持物�
瓊脂糖凝膠商品名很多,常見的��
Sepharose(瑞典,pharmacia),Bio-Gel-A(美�,Bio-Rad)等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀�(jié)�(gòu),網(wǎng)狀�(jié)�(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下,它的結(jié)�(gòu)是穩(wěn)定的,可以在許多條件下使用(如水,pH4-9范圍�(nèi)的鹽溶液�。瓊脂糖凝膠�40℃以上開始融�,也不能高壓消毒,可用化�(xué)滅菌活處理。聚苯乙烯凝�
商品為Styrogel,具有大�(wǎng)孔結(jié)�(gòu),可用于分離分子�1600�40�000�000的生物大分子,適用于有機多聚�,分子量測定和脂溶性天然物的分�,凝膠機械強度好,洗脫劑可用甲基亞砜�
凝膠色譜填料合成技�(shù)的進展主要在下面四個方面:填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔徑多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化學(xué)改性的�(fā)�。在這方面有較多的新�(chǎn)品,中國也有許多單位在研制和生產(chǎn)。高效凝膠色譜正在迅速改變凝膠色譜的�(yīng)用面�
四種多孔硅膠的理論塔板數(shù)
高效色譜柱除了對填料的粒度有要求�,對粒度分布也要求相�(dāng)�。用一般的制備方法往往得到粒度較寬的產(chǎn)�,需要進一步過篩。當(dāng)填料的粒度在30微米以下時,這種過篩非常困難,已�(jīng)成為填料制備上一個較大的技�(shù)難關(guān)。Kirkland,利用了尿素和甲醛在酸性介�(zhì)中形成大小均勻的液體高聚物,加入某種硅溶膠時,硅溶膠的微珠將在液體高聚物中凝聚。把有機高聚物灼燒掉后就能得到由微粒硅珠堆積而成的多孔填�。這種堆積硅珠是球形的,粒度分布很�,填料的孔徑?jīng)Q定于原始硅溶膠的�(guī)�,用不同的硅膠就可以制得不同孔徑的填�。柴志寬等則利用一種硅膠制成粒度分布窄的填料后,再利用適當(dāng)?shù)臄U孔方法以得到各種孔徑的填�。從這些方法制得的微球填料,粒度分布可以達到相當(dāng)�,所以可以不�(jīng)篩選直接使用�
� GPC和GPC-LALLS得到PS�(biāo)樣分子量比較
隨著進樣技�(shù)和色譜柱接頭�(shè)計的改�,已�(jīng)可以得到柱效每米在八萬到十萬的凝膠色譜填料。Wheals用四種GPC用的微球硅膠裝填色譜�,都能達到每米八萬到十萬塊塔板數(shù)的高�。他用這種色譜柱有效地進行了案件偵查中所要求的分析問題�
層析�
層析柱是凝膠層析技�(shù)中的主體,一般用玻璃管或有機玻璃�。層析柱的直徑大小不影響分離度,樣品用量�,可加大柱的直徑,一般制備用凝膠�,直徑大�2厘米,但在加樣時�(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外,直徑加大,洗脫液體體積增�,樣品稀釋度�。分離度取決于柱�,為分離不同組分,凝膠柱床必須有適宜的高度,分離度與柱高的平方根相關(guān),但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞,一般不超過1�。分族分離時用短柱,一般凝膠柱�20-30厘米,柱高與直徑的比�5�1─10�1,凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。分級分離時柱高與直徑之線為20�1─100�1,常用凝膠柱�50×25厘米�10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的�,如果支掌濾板下的死體積�,被分離組分之間重新混合的可能性就�,其�(jié)果是影響洗脫峰形,出�(xiàn)拖尾出象,降低分辯力。在精確分離�,死體積不能超過總床體積�1/1000�
凝膠的選�
根據(jù)所需凝膠體積,估計所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量�2�,例如Sephadex G-20的吸水量�20�1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝膠體積�40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好,但阻力�,流速慢。一般實驗室分離蛋白�(zhì)采用100-200號篩目的的Sephadex G-200效果好,脫鹽用Sephadex G-25、G-50,用粗粒,短柱,流速快�
凝膠的制�
商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨�。為了加速膨�,可用加熱法,即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近�,這樣可大大中速膨�,通常�1-2小時�(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時,自然膨脹需24小時至數(shù)�,而用加熱法在幾小時內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時間,而且還可消毒,除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣�
樣品溶液的處�
樣品溶液如有沉淀�(yīng)過濾或離心除�,如含脂類可高速離心或通過Sephadex G-15短柱除去。樣品的粘度不可大,含蛋白為超過4%,粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根�(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4%(一般約0.5-2ml),進行分族分離時樣品液可為凝膠床的10%,在蛋白�(zhì)溶液除鹽時,樣品可達凝膠床的20-30%。分級分離樣品體積要�,使樣品層盡可能窄,洗脫出的峰形較好�
防止微生物的污染
交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì),防止微生物的生�,在凝膠層析中十分重要,常用的抑菌劑有:
?、暖B氨鈉(NaN3�
在凝膠層析中只要�0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長,疊氮鈉易溶于水,在20℃時約為40%;它不與蛋白�(zhì)或碳水化合物相互作用,因此疊氮鈉不影響抗體活�;不會改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)�
⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]
在凝膠層析中使用濃度�0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果,在強堿性溶液中或溫度高�60℃時易引起分解而失��
?、且一鷰€基水楊酸�
在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01%。在微酸性溶液中最為有�。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)�(jié)�,因而包含疏基的蛋白�(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效��
?、缺交}
在凝膠層析中使用濃度�0.001-0.01%。在微堿性溶液中抑效果,長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀;還原劑可引起此化合物分�;含巰基的物�(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用�
凝膠色譜的大量研究工作仍是多方面�,其中儀�、填�、聯(lián)用技�(shù)、色譜理論等方面的進展是和整個液體色譜的進展相關(guān)�。但是下面四個研究動向意義較�,值得注意�
通過與其他儀器聯(lián)�,解決凝膠色譜法測定高聚物分子量分布從相對法向法過渡。測定高聚物分子量分布是凝膠色譜最重要的應(yīng)�。試樣先根據(jù)分子體積(即分子量)分離后再檢測各組分的分子量及含量。在凝膠色譜中試樣的分離是在色譜柱中進行�,被分離后的組分在流出柱子時就同時連續(xù)地用濃度檢測器和分子量檢測器分別檢側(cè)各組分的濃度和分子量,把兩個檢測器的輸出訊號用記錄儀記錄后即得反映分子量分布的凝膠色譜曲線。過去由于沒有比較靈敏和瞬時響應(yīng)的分子量檢測�,因而利用一組不同分子量的標(biāo)樣來�(biāo)定色譜柱,然后從分子量淋出休積的�(biāo)定曲線來作數(shù)�(jù)換算。這種用相對方法來檢測分子量雖然暫時解決了問題,但是隨之而來的是實驗工作量增加以及數(shù)�(jù)處理方法上存在困�。實驗數(shù)�(jù)的可靠性在很大程度上決定于�(biāo)定曲線、標(biāo)樣分子量�(shù)值以及數(shù)�(jù)處理方法的可靠�。其中色譜柱分離效率不理想所引起的色譜峰加寬效應(yīng)的改�,不但實驗方法比較煩�,而且�(shù)�(jù)處理也比較復(fù)雜,需要用電子計算機來計算。所以雖然文獻中已經(jīng)推薦許多�(jù)說是比較滿意的計算方�,但這總不是一個根本解決的方法。只有真正找到分子量檢測�,問題才算較好解�。原有的許多分子量測定方�,由于不能做到足夠靈敏的瞬時響應(yīng)而未能成功地在凝膠色譜上�(yīng)用�
Ouano用激光小角光散射儀(LALLS)來作分子量檢測器得到比較好的�(jié)�。實驗數(shù)�(jù)不需要標(biāo)定曲線,也不必進行峰加寬改��
由于激光的�(zhǔn)直性較�,強度較�,可以允許在較小的角度下測量較稀溶液的散射光強,由此可以直接計算出重均分子量的近似值而不需要象�(jīng)典光散射那樣實驗�(shù)�(jù)還要對濃度和散射角度向零作雙外推。實驗上,凝膠色譜儀和激光小角光散射儀�(lián)用后,還可與計算機直接聯(lián)接進行�(shù)�(jù)處理。在一次實驗進行完畢�,所需要的�(shù)�(jù)可全部立即取�。GPC-LALLS似乎得到更合理的�(shù)�。激光小角散射儀已開始商品化,預(yù)計不久將會有更多的研究工�,來說明已經(jīng)在何種程度上解決了凝膠色譜的相對測定過渡到測定。凝膠色譜中的濃度檢測器和通常的液體色譜一樣仍然是一個薄弱環(huán)節(jié),繼�(xù)在尋找更理想的檢測器。目前最常用的仍然是示差折光檢測器和紫外檢測��
Hoffmann和Urban用自動濁度滴定裝置來作濃度檢測器也收到一定效果,特別對二元共聚中測定分子量分布和組成分布,效果比較顯�。Jorgenson等用光散射法�(cè)定淋出溶�(zhì)的沉淀,也證明是一個較靈敏的方�。Francois等用密度計來檢側(cè)濃度,提供了另一條通用性檢測器的途徑。其他如�(zhì)譜和原子吸收光譜也都能與凝膠色譜�(lián)用。隨著應(yīng)用的擴大,凝膠色譜可以用于測定高聚物長支鏈的支化度�
高效凝膠色譜
在整個液體色譜領(lǐng)域里,高效液體色譜取代經(jīng)典的液體色譜的趨勢是非常迅速的。這是由于色譜理論、填料制備技�(shù)和儀器合理設(shè)計三方面�(lián)合發(fā)展的必然�(jié)�。凝膠色譜向高效階段�(fā)展就其本身來�,又是一次意義較大的進展,因為凝膠色譜雖然具有許多優(yōu)�,但是它一直被�(rèn)為是一種分離效率比較低、色譜柱的峰容量小和速度慢的技�(shù)。在廣泛的非高分子化合物�(lǐng)域中沒有得到�(yīng)有的使用�
在經(jīng)典的凝膠色譜�,填料的粒度一般用37-75μ。色譜柱�12尺以�,柱�7.8毫米,流速通常�1毫升/�。在這些條件�,一次實驗時間往往需要三小時。加快流速會降低分離效率,因為凝膠色譜是一個由擴散控制的分離過�,高分子在溶液中擴散較慢,這就必然使流速受到一定限制。凝膠色譜峰容量較小的原因是和體積排除的分離機理有關(guān)。這些缺陷的克服都有待于填料柱效的大幅度提�。高效凝膠色譜填料的合成成功以及高效裝柱技�(shù)的發(fā)�,實�(xiàn)了柱效的提高,從而實�(xiàn)了實驗時間縮�,峰寬變窄和峰容量增加�
�(xiàn)在粒度為10μ的填料可以使分子量分布測定時間從三小時縮短到十幾分鐘,這個時間甚至比高分子在溶劑中溶解所需的時間還�。在工業(yè)上已有人用凝膠色譜圖來作為訂購驗收指定分子量分布的高聚物�(chǎn)品。由于不需要費太多時間來做條件試驗,凝膠色譜在一般化合物�(lǐng)域里�(yīng)用時的方便程度已可以和其他類型高效液體色譜相競爭�
維庫電子�,電子知�,一查百通!
已收錄詞�153979�