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凝膠色譜�
閱讀�4019�(shí)間:2018-06-01 10:28:56

凝膠色譜法又叫凝膠色譜技�(shù),是六十年代初發(fā)展起�(lái)的一種快速而又�(jiǎn)單的分離分析技�(shù),由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方�,不需要有�(jī)溶劑,對(duì)高分子物�(zhì)有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜��

�(jiǎn)要介�

  凝膠色譜法又叫凝膠色譜技�(shù),是六十年代初發(fā)展起�(lái)的一種快速而又�(jiǎn)單的分離分析技�(shù),由于設(shè)備簡(jiǎn)�、操作方�,不需要有�(jī)溶劑,對(duì)高分子物�(zhì)有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相對(duì)分子�(zhì)量分�(jí)分析以及相對(duì)分子�(zhì)量分布測(cè)�。根�(jù)分離的對(duì)象是水溶性的化合物還是有�(jī)溶劑可溶�,又可分為凝膠過(guò)濾色譜(GFC)和凝膠滲透色譜(GPC�。GFC一般用于分離水溶性的大分�,如多糖�(lèi)化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列,洗脫溶劑主要是水�
  凝膠滲透色譜法主要用于有機(jī)溶劑中可溶的高聚�(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對(duì)分子�(zhì)量分布分析及分離,常用的凝膠為交�(lián)聚苯乙烯凝膠,洗脫溶劑為四氫呋喃等有�(jī)溶劑。凝膠色譜不但可以用于分離測(cè)定高聚物的相�(duì)分子�(zhì)量和相對(duì)分子�(zhì)量分�,同�(shí)根據(jù)所用凝膠填料不同,可分離油溶性和水溶性物�(zhì),分離相�(duì)分子�(zhì)量的范圍從幾百萬(wàn)�100以下。近年來(lái),凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物。化�(xué)�(jié)�(gòu)不同但相�(duì)分子�(zhì)量相近的物質(zhì),不可能通過(guò)凝膠色譜法達(dá)到完全的分離純化的目�。凝膠色譜主要用于高聚物的相�(duì)分子�(zhì)量分�(jí)分析以及相對(duì)勿子�(zhì)量分布測(cè)�。目前已�(jīng)被生物化�(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及�(yī)�(xué)等有�(guān)�(lǐng)域廣泛采�,不但應(yīng)用于科學(xué)�(shí)�(yàn)研究,而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)�

基本理論

  分子篩效�
  兩種全排阻的分子即使大小不同,也不能有分離效�。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能�(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部�(jìn)入凝膠孔�,即使它們的大小有差�,也不會(huì)有好的分離效�。因此,一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所�,在凝膠色譜中會(huì)有三種情況,一是分子很�,能�(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙;二是分子很�,完全不能�(jìn)入凝膠的任何�(nèi)孔隙;三是分子大小適�,能�(jìn)入凝膠的�(nèi)孔隙中孔徑大小相�(yīng)的部�。大、中、小三類(lèi)分子彼此間較易分�(kāi),但每種凝膠分離范圍之外的分�,在不改變凝膠種�(lèi)的情況下是很難分離的。對(duì)于分子大小不�,但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子,在凝膠床中的分布情況是不同的:分子較大的只能�(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙�(nèi),而分子較小的可�(jìn)入較多的凝膠顆粒�(nèi),這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動(dòng)距離較短,分子較小的移動(dòng)距離較長(zhǎng)。于是分子較大的先通過(guò)凝膠床而分子較小的后通過(guò)凝膠�,這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另�,凝膠本身具有三維網(wǎng)狀�(jié)�(gòu),大的分子在通過(guò)這種�(wǎng)狀�(jié)�(gòu)上的孔隙�(shí)阻力較大,小分子通過(guò)�(shí)阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過(guò)凝膠床時(shí),按照分子量大小“排�(duì),凝膠表�(xiàn)分子篩效�(yīng)�
  重要參數(shù)
 ?、胖w積:柱體積是指凝膠裝柱后,從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床,因引柱體積又稱“床”體�,常用Vt表示�
  ⑵外水體積:色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙,這部分體積稱外水體積,亦稱間隙體�,常用Vo表示�
 ?、莾?nèi)水體積:�?yàn)槟z為三維網(wǎng)狀�(jié)�(gòu),顆粒內(nèi)部仍有空�,液體可�(jìn)入顆粒內(nèi)�,這就分間隙的總和為內(nèi)水體�,又稱定相體積,常用Vi表示。不包括固體支持物的體積(Vg)�
 ?、确逑疵擉w積:是指被分離物�(zhì)通過(guò)凝膠柱所需洗脫液有體積,常用Ve表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時(shí),(與洗脫體積比較可以忽略不�(jì)�,在洗脫圖中,從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時(shí),洗脫體積計(jì)算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大�(shí),洗脫體積計(jì)算可以從�(yīng)用樣品開(kāi)始到洗脫峰升高的彎曲�(diǎn)(或半高處)�

填料合成

  凝膠色譜填料合成技�(shù)的�(jìn)展主要在下面四�(gè)方面:填料的微球�、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔徑多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化學(xué)改性的�(fā)�。近年來(lái)在這方面有較多的新�(chǎn)�,中�(guó)也有許多單位在研制和生產(chǎn)。高效凝膠色譜正在迅速改變凝膠色譜的�(yīng)用面�
  高效色譜柱除了對(duì)填料的粒度有要求�,對(duì)粒度分布也要求相�(dāng)�。用一般的制備方法往往得到粒度較寬的產(chǎn)�,需要�(jìn)一步過(guò)�。當(dāng)填料的粒度在30微米以下�(shí),這種�(guò)篩非常困難,已經(jīng)成為填料制備上一�(gè)較大的技�(shù)難關(guān)。Kirkland,最近利用了尿素和甲醛在酸性介�(zhì)中形成大小均勻的液體高聚�,加入某種硅溶膠�(shí),硅溶膠的微珠將在液體高聚物中凝聚。把有機(jī)高聚物灼燒掉后就能得到由微粒硅珠堆積而成的多孔填�。這種堆積硅珠是球形的,粒度分布很�,填料的孔徑?jīng)Q定于原始硅溶膠的�(guī)�,用不同的硅膠就可以制得不同孔徑的填�。柴志寬等則利用一種硅膠制成粒度分布窄的填料后,再利用適當(dāng)?shù)臄U(kuò)孔方法以得到各種孔徑的填�。從這些方法制得的微球填�,粒度分布可以達(dá)到相�(dāng)�,所以可以不�(jīng)篩選直接使用�
  隨著�(jìn)樣技�(shù)和色譜柱接頭�(shè)�(jì)的改�(jìn),現(xiàn)在已�(jīng)可以得到柱效每米在八�(wàn)到十�(wàn)的凝膠色譜填料。Wheals用四種GPC用的微球硅膠裝填色譜�,都能達(dá)到每米八�(wàn)到十�(wàn)塊塔板數(shù)的高效。他用這種色譜柱有效地�(jìn)行了案件偵查中所要求的分析問(wèn)��

兩大分類(lèi)

  根據(jù)分離的對(duì)象是水溶性的化合物還是有�(jī)溶劑可溶物,又可分為凝膠�(guò)濾色譜(GFC)和凝膠滲透色譜(GPC��
  凝膠�(guò)濾色�
  凝膠�(guò)濾色譜一般用于分離水溶性的大分�,如多糖�(lèi)化合�。凝膠的代表是葡萄糖系列,洗脫溶劑主要是水�
  凝膠滲透色�
  凝膠滲透色譜法主要用于有機(jī)溶劑中可溶的高聚� (聚苯乙烯、聚氯已�、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相對(duì)分子�(zhì)量分布分析及分離,常用的凝膠為交�(lián)聚苯乙烯凝膠,洗脫溶劑為四氫呋喃等有�(jī)溶劑�
  凝膠色譜不但可以用于分離�(cè)定高聚物的相�(duì)分子�(zhì)量和相對(duì)分子�(zhì)量分�,同�(shí)根據(jù)所用凝膠填料不同,可分離油溶性和水溶性物�(zhì),分離相�(duì)分子�(zhì)量的范圍從幾百萬(wàn)�100以下�
  近年�(lái),凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物?;瘜W(xué)�(jié)�(gòu)不同但相�(duì)分子�(zhì)量相近的物質(zhì),不可能通過(guò)凝膠色譜法達(dá)到完全的分離純化的目��

凝膠種類(lèi)及性質(zhì)

  聚丙烯酰胺凝�
  是一種人工合成凝膠,是以丙烯酰胺為單�,由甲叉雙丙烯酰胺交�(lián)成的,經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀,控制交�(lián)劑的用量可制成各種型�(hào)的凝膠。交�(lián)劑越�,孔隙越�。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-P(Bio-GelP),由日本tosoh的TSKGEL的pw系列,適合蛋白和多糖的純��
  交聯(lián)葡聚糖凝�
  ⑴SephadexG交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephadex,不同規(guī)格型�(hào)的葡聚糖用英文字母G表示,G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10�。例�,G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克,同樣G-200克每克干膠吸�20�。交�(lián)葡聚糖凝膠的種類(lèi)有G-10,G-15,G-25,G-50,G-75,G-100,G-150,和G-200。因�,“G”反�,凝膠的交聯(lián)程度,膨脹程度及分部范圍�
 ?、芐ephadexLH-20,是─SephadexG-25的羧丙基衍生物,能溶于水及親脂溶�,用于分離不溶于水的物質(zhì)�
  瓊脂糖凝�
  商品名很多,常見(jiàn)的有,Sepharose(瑞典,pharmacia�,Bio-Gel-A(美�(guó)Bio-Rad)等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級(jí)鏈如氫鍵�(lái)維持�(wǎng)狀�(jié)�(gòu),網(wǎng)狀�(jié)�(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃�。一般情況下,它的結(jié)�(gòu)是穩(wěn)定的,可以在許多條件下使用(如水,pH4-9范圍�(nèi)的鹽溶液�。瓊脂糖凝膠�40℃以上開(kāi)始融�,也不能高壓消毒,可用化�(xué)滅菌活處��
  聚苯乙烯凝膠
  商品為Styrogel,具有大�(wǎng)孔結(jié)�(gòu),可用于分離分子�1600�40�000�000的生物大分子,適用于有機(jī)多聚�,分子量�(cè)定和脂溶性天然物的分�(jí),凝膠機(jī)械強(qiáng)度好,洗脫劑可用甲基亞砜�

�(shí)�(yàn)技�(shù)

  層析�
  層析柱是凝膠層析技�(shù)中的主體,一般用玻璃管或有機(jī)玻璃�。層析柱的直徑大小不影響分離�,樣品用量大,可加大柱的直徑,一般制備用凝膠�,直徑大�2厘米,但在加樣時(shí)�(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此�,直徑加�,洗脫液�
  體積增大,樣品稀釋度�。分離度取決于柱�,為分離不同組分,凝膠柱床必須有適宜的高�,分離度與柱高的平方根相�(guān),但由于軟凝膠柱�(guò)高擠壓變形阻�,一般不超過(guò)1米。分族分離時(shí)用短�,一般凝膠柱�(zhǎng)20-30厘米,柱高與直徑的比�5:1─10:1,凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10�。分�(jí)分離�(shí)柱高與直徑之線為20:1─100:1,常用凝膠柱�50×25厘米�10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的�,如果支掌濾板下的死體積大,被分離組分之間重新混合的可能性就�,其�(jié)果是影響洗脫峰形,出�(xiàn)拖尾出象,降低分辯力。在精確分離�(shí),死體積不能超過(guò)總床體積�1/1000�
  凝膠的選�
  根據(jù)所需凝膠體積,估�(jì)所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸�
  凝膠色譜�
  量的2倍,例如SephadexG-20的吸水量�20�1克SephadexG─200吸水后形成的凝膠體積�40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好,但阻力�,流速慢。一般實(shí)�(yàn)室分離蛋白質(zhì)采用100-200�(hào)篩目的的SephadexG-200效果�,脫鹽用SephadexG-25、G-50,用粗粒,短�,流速快�
  凝膠的制�
  凝膠色譜法相�(guān)儀�
  商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨�。為了加速膨脹,可用加熱�,即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近�,這樣可大大中速膨�,通常�1-2小時(shí)�(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時(shí),自然膨脹需24小時(shí)至數(shù)�,而用加熱法在幾小�(shí)�(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時(shí)間,而且還可消毒,除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空��
  樣品溶液處理
  樣品溶液如有沉淀�(yīng)�(guò)濾或離心除去,如含脂�(lèi)可高速離心或通過(guò)SephadexG
  凝膠色譜�
  -15短柱除去。樣品的粘度不可大,含蛋白為超過(guò)4%,粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根�(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4%(一般約0.5-2ml�,�(jìn)行分族分離時(shí)樣品液可為凝膠床�10%,在蛋白�(zhì)溶液除鹽�(shí),樣品可�(dá)凝膠床的20-30%。分�(jí)分離樣品體積要小,使樣品層盡可能�,洗脫出的峰形較好�
  防止微生物污�
  交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類(lèi)物質(zhì),防止微生物的生�(zhǎng),在凝膠層析中十分重要,常用的抑菌劑�:
 ?、暖B氨鈉(NaN3�
  凝膠色譜�
  在凝膠層析中只要�0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長(zhǎng),疊氮鈉易溶一水,�20℃時(shí)約為40%;它不與蛋白�(zhì)或碳水化合物相互作用,因此疊氮鈉不影響抗體活�;不�(huì)改變蛋白�(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)�
 ?、瓶�?lè)酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]
  在凝膠層析中使用濃度�0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果,在�(qiáng)堿性溶液中或溫度高�60℃時(shí)易引起分解而失��
 ?、且一鷰€基水楊酸�
  在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0.01%。在微酸性溶液中最為有�。重�
  凝膠色譜�
  屬離子可使乙基代巰基的物�(zhì)�(jié)合,因而包含疏基的蛋白�(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效��
 ?、缺交}
  在凝膠層析中使用濃度�0.001-0.01%。在微堿性溶液中抑效果,�(zhǎng)�(shí)間放置時(shí)可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀;還原劑可引起此化合物分�;含疏基的物�(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用�

研究�(dòng)�

  凝膠色譜的大量研究工作仍是多方面�,其中儀�、填�、聯(lián)用技�(shù)、色譜理論等方面的�(jìn)展是和整�(gè)液體色譜的�(jìn)展相�(guān)�。但是下面四�(gè)研究�(dòng)向意義較�,值得注意�
  通過(guò)與其他儀器聯(lián)�,解決凝膠色譜法�(cè)定高聚物分子量分布從相對(duì)法向法過(guò)渡。測(cè)定高聚物分子量分布是凝膠色譜最重要的應(yīng)�。試樣先根據(jù)分子體積(即分子量)分離后再檢測(cè)各組分的分子量及含量。在凝膠色譜中試樣的分離是在色譜柱中�(jìn)行的,被分離后的組分在流出柱子時(shí)就同�(shí)連續(xù)地用濃度檢測(cè)器和分子量檢�(cè)器分別檢�(cè)各組分的濃度和分子量,把兩�(gè)檢測(cè)器的輸出訊號(hào)用記錄儀記錄后即得反映分子量分布的凝膠色譜曲�。過(guò)去由于沒(méi)有比較靈敏和瞬時(shí)響應(yīng)的分子量檢測(cè)器,因而利用一組不同分子量的標(biāo)樣來(lái)�(biāo)定色譜柱,然后從分子量淋出休積的�(biāo)定曲線來(lái)作數(shù)�(jù)換算。這種用相�(duì)方法�(lái)檢測(cè)分子量雖然暫�(shí)解決了問(wèn)�,但是隨之而來(lái)的是�(shí)�(yàn)工作量增加以及數(shù)�(jù)處理方法上存在困�。實(shí)�(yàn)�(shù)�(jù)的可靠性在很大程度上決定于�(biāo)定曲�、標(biāo)樣分子量�(shù)值以及數(shù)�(jù)處理方法的可靠�。其中色譜柱分離效率不理想所引起的色譜峰加寬效應(yīng)的改正,不但�(shí)�(yàn)方法比較煩瑣,而且�(shù)�(jù)處理也比較復(fù)�,需要用電子�(jì)算機(jī)�(lái)�(jì)算。所以雖然文�(xiàn)中已�(jīng)推薦許多�(jù)�(shuō)是比較滿意的�(jì)算方�,但這總不是一�(gè)根本解決的方法。只有真正找到分子量檢測(cè)�,問(wèn)題才算較好解決。原有的許多分子量測(cè)定方�,由于不能做到足夠靈敏的瞬時(shí)響應(yīng)而未能成功地在凝膠色譜上�(yīng)��
  最近Ouano用激光小角光散射儀(LALLS)�(lái)作分子量檢測(cè)器得到比較好的結(jié)�。實(shí)�(yàn)�(shù)�(jù)不需要標(biāo)定曲�,也不必�(jìn)行峰加寬改正�
  由于激光的�(zhǔn)直性較�,強(qiáng)度較�,可以允許在較小的角度下�(cè)量較稀溶液的散射光�(qiáng),由此可以直接計(jì)算出重均分子量的近似值而不需要象�(jīng)典光散射那樣�(shí)�(yàn)�(shù)�(jù)還要�(duì)濃度和散射角度向零作雙外�。實(shí)�(yàn)上,凝膠色譜儀和激光小角光散射儀�(lián)用后,還可與�(jì)算機(jī)直接�(lián)接�(jìn)行數(shù)�(jù)處理。在一次實(shí)�(yàn)�(jìn)行完畢后,所需要的�(shù)�(jù)可全部立即取�。GPC-LALLS似乎得到更合理的�(shù)�。激光小角散射儀已開(kāi)始商品化,預(yù)�(jì)不久將會(huì)有更多的研究工作,來(lái)�(shuō)明已�(jīng)在何種程度上解決了凝膠色譜的相對(duì)�(cè)定過(guò)渡到�(cè)��
  凝膠色譜中的濃度檢測(cè)器和通常的液體色譜一樣仍然是一�(gè)薄弱�(huán)節(jié),繼�(xù)在尋找更理想的檢�(cè)�。目前最常用的仍然是示差折光檢測(cè)器和紫外檢測(cè)��
  最近Hoffmann和Urban用自�(dòng)濁度滴定裝置�(lái)作濃度檢�(cè)器也收到一定效�,特別對(duì)二元共聚中測(cè)定分子量分布和組成分�,效果比較顯�。Jorgenson等用光散射法�(cè)定淋出溶�(zhì)的沉淀,也證明是一�(gè)較靈敏的方法。Francois等用密度�(jì)�(lái)檢側(cè)濃度,提供了另一條通用性檢�(cè)器的途徑。其他如�(zhì)譜和原子吸收光譜也都能與凝膠色譜�(lián)用。隨著應(yīng)用的�(kuò)�,凝膠色譜可以用于測(cè)定高聚物�(zhǎng)支鏈的支化度�

維庫(kù)電子�,電子知�(shí),一查百��

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