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超微量分光光度計(jì)
閱讀�1937�(shí)間:2022-04-28 17:27:13

    超微量分光光度計(jì)是一類很重要的分析儀�,無論在物理學(xué)、化�(xué)、生物學(xué)、醫(yī)�(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科�(xué)等科�(xué)研究�(lǐng)� ,還是在化�、醫(yī)�、環(huán)境檢�、冶金等�(xiàn)代生�(chǎn)與管理部門 ,紫外可見分光光度�(jì)都有廣泛而重要的�(yīng)用�

常見的用�

    分光光度�(jì)是一類很重要的分析儀�,無論在物理學(xué)、化�(xué)、生物學(xué)、醫(yī)�(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科�(xué)等科�(xué)研究�(lǐng)� ,還是在化�、醫(yī)藥、環(huán)境檢�、冶金等�(xiàn)代生�(chǎn)與管理部門 ,紫外可見分光光度�(jì)督有廣泛而重要的�(yīng)用。分光光度計(jì)就是利用分光光度法對物質(zhì)�(jìn)行定量定性分析的儀�,常用于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量�
    超微量分光光度計(jì)已成為現(xiàn)代分子生物實(shí)�(yàn)室常�(guī)儀�。常用于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量�
    核酸的定�
    核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷�,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波�260 nm。每種核酸的分子�(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應(yīng)的系�(shù)。如�1OD 的吸光值分別相�(dāng)�50μg/ml的dsDNA�37μg/ml的ssDNA�40μg/ml的RNA�30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系�(shù)的換算,從而得出相�(yīng)的樣品濃�。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體�,爾后測試空白液和樣品液。然�,實(shí)�(yàn)并非一帆風(fēng)�。讀�(shù)不穩(wěn)定可能是�(shí)�(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀�,表�(xiàn)出的吸光值漂移越大�
    事實(shí)�,分光光度計(jì)的設(shè)�(jì)原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即儀器有一定的�(zhǔn)確度和精確度。如德國伯赫Colibri超微量分光光度計(jì)的準(zhǔn)確度�1.0%�1A�。這樣多次測試的結(jié)果在均�1.0%左右之間變動(dòng),都是正常的。另�,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH�,離子濃度等:在測試�(shí),離子濃度太�,也會導(dǎo)致讀�(shù)漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖�,如TE,可大大�(wěn)定讀�(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試�(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大�0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi),顆粒的干擾相對較小,結(jié)果穩(wěn)�。從而意味著樣品的濃度不能過�,或者過高(超過光度�(jì)的測試范圍)。最后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太�,甚至出�(xiàn)�(fù)值;混合液不能存在氣�,空白液無懸浮物,否則讀�(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣�,否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一�;不能采用窗口磨損的比色�;樣品的體積必須�(dá)到比色杯要求的最小體積等多�(gè)操作事項(xiàng)�
    除了核酸濃度,分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾�(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評估樣品的純�,因?yàn)榈鞍椎奈辗�?80nm。純凈的樣品,比值大�1.8(DNA)或�2.0(RNA�。如果比值低�1.8 或�2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物�(zhì)的影�。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大�2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因�。純樣品,A320一般是0�
    蛋白�(zhì)直接定量
    這種方法是在280nm波長,直接測試蛋�。選擇Warburg 公式,光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方�,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,先測試空白�,然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜�(zhì),一般要消除320nm 的“背景”信息,�(shè)定此功能“開�。與測試核酸類似,要求A280的吸光值至少大�0.1A,最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)�(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度�(shí),發(fā)�(xiàn)讀�(shù)“漂移�。這是一�(gè)正常的現(xiàn)�。事�(shí)上,只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超�1%,表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閃arburg 公式吸光值換算成濃度,乘以一定的系數(shù),只要吸光值有少許改變,濃度就會被放大,從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)�。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度�,操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干�,如DNA的干�;另外敏感度�,要求蛋白的濃度較高�
    比色法蛋白質(zhì)定量
    蛋白�(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,比色法測定的基�(chǔ)是蛋白質(zhì)�(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基�(tuán)或者染料反�(yīng),產(chǎn)生有色物�(zhì)。有色物�(zhì)的濃度與蛋白�(zhì)反應(yīng)的氨基酸�(shù)目直接相�(guān),從而反�(yīng)蛋白�(zhì)濃度�
    比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方��
    Lowry 法:以最早期的Biuret 反應(yīng)為基�(chǔ),并有所改�(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比,Lowry 法敏感性更高。缺�(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反�(yīng)需要的�(shí)間較長;容易受到非蛋白物�(zhì)的影�;含EDTA,Triton x-100,ammonia sulfate 等物�(zhì)的蛋白不適合此種方法�
    BCA(Bicinchoninine acid assay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)�(chǎn)生Cu ,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合�,吸收峰�562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極�(qiáng),反�(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)�。相對于Lowry�,操作簡�,敏感度�。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾�
    Bradford 法:這種方法的原理是蛋白�(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反�(yīng),產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點(diǎn)�,敏感度�,是Lowry 和BCA 兩種測試方法�2 �;操作更簡單,速度更快;只需要一種反�(yīng)試劑;化合物可以�(wěn)�1小時(shí),方便結(jié)�;而且與一系列干擾Lowry,BCA 反應(yīng)的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺�(diǎn)是不同的�(biāo)�(zhǔn)品會�(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,無可比��
    某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的�(jié)果并不一�,感到迷�,究竟該相信哪種方法?由于各種方法反�(yīng)的基�(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,所以同�(shí)使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如:Keller等測試人奶中的蛋�,結(jié)果Lowry,BCA 測出的濃度明顯高于Bradford,差異顯�。即使是測定同一樣品,同一種比色法選擇的標(biāo)�(zhǔn)樣品不一�,測試后的濃度也不一�。如用Lowry測試�(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),以BSA作標(biāo)�(zhǔn)�,濃�1.34mg/ml,以a球蛋白作�(biāo)�(zhǔn)品,濃度2.64mg/ml。因�,在選擇比色法之前,最好是參照要測試的樣本的化�(xué)�(gòu)�,尋找化�(xué)�(gòu)成類似的�(biāo)�(zhǔn)蛋白作標(biāo)�(zhǔn)�。另外,比色法定量蛋白質(zhì),經(jīng)常出�(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低,�(dǎo)致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是,反�(yīng)�1011分光光度�(jì)的重要配件—� 比色杯的顏色是有一定的半衰�,所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試�(shí)�,所有的樣品(包括標(biāo)�(zhǔn)樣品�,都必須在此�(shí)間內(nèi)測試。時(shí)間過�,得到的吸光值變小,換算的濃度值降�。除此,反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響�(shí)�(yàn)的重要原�。此�,非常重要的�,最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材�(zhì)的比色杯,因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著�,導(dǎo)致樣品吸光值不�(zhǔn)確�
    OD 600
    �(shí)�(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長�,多根據(jù)�(jīng)�(yàn)和目測推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實(shí)�(yàn),需要采用分光光度計(jì)�(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密�。OD600是追蹤液體培�(yǎng)物中微生物生長的�(biāo)�(zhǔn)方法。以未加菌液的培�(yǎng)液作為空白液,之后定量培�(yǎng)后的含菌培養(yǎng)�。為了保證正確操�,必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡�(jìn)行細(xì)胞計(jì)�(shù),做出校正曲�。實(shí)�(yàn)中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出�(xiàn)�(fù)�,原因是采用了顯色的培養(yǎng)�,即�(xì)菌培�(yǎng)一段時(shí)間后,與培養(yǎng)基反�(yīng),發(fā)生變色反�(yīng)。另�,需注意的是,測試的樣品不能離心,保持細(xì)菌懸浮狀�(tài)�

主要�(jié)�(gòu)

    各種型號的分光光度計(jì)基本�(jié)�(gòu)都相�,由如下五種部分組成�
    1)光源(鎢燈、鹵鎢燈,氫弧燈,氘�、氙燈或激光光�)�
    2)單色�(濾光�、棱�、光�、全息柵)�
    3)樣品吸收��
    4)檢測系統(tǒng)(光電池、光電管、光電倍增�)�
    5)信號指示系統(tǒng)(檢流�(jì)、微安表、數(shù)字電壓表、示波器、微處理�(jī)顯像�)�
    光源-單色�-樣品吸收�-檢測系統(tǒng)-信號指示系統(tǒng)�

區(qū)�

    與傳�(tǒng)光度�(jì)的區(qū)�
    傳統(tǒng)分光光度�(jì)�
    樣品體積要求�,絕大部分要50μL以上
    需使用比色�
    每次換樣品時(shí),比色杯需要清�,工作繁�
    光程一般為10mm,樣品需要稀�,測量濃度范圍小
    燈源一般由氘燈(紫外)和鎢�(可見)組成,壽命短
    需要預(yù)熱半�(gè)小時(shí)以上
    顯示吸光度值,不顯示濃度�
    儀器體積大,質(zhì)量重
    超微量分光光度計(jì)
    所需樣品體積�,僅需1�2μL
    不需要比色皿,用移液槍直接將樣品滴加到檢測平臺上,測量時(shí)樣品自動(dòng)形成液柱,檢測完成后只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測平臺上擦拭干凈即可
    具有1mm�0.2mm兩�(gè)光程(電機(jī)控制自動(dòng)選擇光程),樣品無需稀釋,測量范圍可達(dá)到常�(guī)分光光度�(jì)�50�
    氙氣閃光燈為燈源,壽命長,性能�(wěn)�
    不需要預(yù)�,可隨時(shí)檢測
    顯示吸光度值的同時(shí),程序直接給出濃度值(核酸、蛋白和熒光染料�
    體積?。合�?dāng)于一本字典大�,僅�16.5厘米�(shí)�(yàn)室空�

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