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PCR�(kuò)增儀
閱讀�2164�(shí)間:2022-03-30 14:44:11

    聚合酶鏈鎖反�(yīng),Polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱PCR,是一種分子生物學(xué)技�(shù),用于擴(kuò)增特定的DNA片段,這種方法可在生物體外�(jìn)�,不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物�。PCR這項(xiàng)技�(shù),被廣泛地運(yùn)用在�(yī)�(xué)和生物學(xué)的實(shí)�(yàn)�,例如用于判斷檢體中是否�(huì)表現(xiàn)某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診�、基因復(fù)�,以及親子鑒��

基本概念

    聚合酶鏈鎖反�(yīng),Polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱PCR,是一種分子生物學(xué)技�(shù),用于擴(kuò)增特定的DNA片段,這種方法可在生物體外�(jìn)�,不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物�。PCR這項(xiàng)技�(shù),被廣泛地運(yùn)用在�(yī)�(xué)和生物學(xué)的實(shí)�(yàn)�,例如用于判斷檢體中是否�(huì)表現(xiàn)某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診�、基因復(fù)�,以及親子鑒定�

歷史�(fā)�

    PCR這項(xiàng)技�(shù)是由凱利·穆利�(Kary Mullis)�(fā)�,并因此在七年之��1993�10�,獲得了諾貝爾化�(xué)�(jiǎng)該項(xiàng)殊榮。穆利斯的想法是,利用一種人工方法,和反�(fù)相同程序的方�,并利用一種特殊的酶——即DNA聚合酶來(lái)�(kuò)增特定的DNA片段�

    DNA聚合酶天然存在于生物體內(nèi),在�(xì)胞分裂前�(jìn)行DNA的復(fù)�。當(dāng)DNA�(kāi)始復(fù)制時(shí),解旋酶將雙股的DNA分開(kāi)成兩�(gè)單股。DNA聚合酶便�(jié)合在兩DNA單股鏈上,生成互�(bǔ)鏈。在穆利斯初的PCR反應(yīng)�,將DNA聚合酶用于體外試�(yàn)。雙鏈DNA被加熱到96�,使得雙鏈分離成為兩條單�。但是在這�(gè)溫度�,DNA聚合酶被破壞,因此在每�(gè)循環(huán)的加熱步驟后必須�(bǔ)充新的聚合酶。穆利斯的原始PCR反應(yīng)效率極低,需要大量時(shí)間和DNA聚合�,并且在整�(gè)PCR反應(yīng)中都需要人�(lái)照看�

    后來(lái),由嗜熱�(xì)菌水生棲熱菌(Thermus aquaticus)體內(nèi)�(chǎn)生的DNA聚合酶改善了這種低效的PCR反應(yīng)。由于嗜熱細(xì)菌生活在溫度�(dá)�50�80 °C (122�176 °F)的間歇泉�,它的DNA聚合酶具有耐熱�。在用于PCR反應(yīng)�(shí),高溫并不能破壞這種DNA聚合�,因此不需要不斷加入新的聚合酶,PCR反應(yīng)由此變得�(jiǎn)單并且可以由�(jī)器操��

    初的具有耐熱性的DNA聚合酶來(lái)自于水生棲熱�(Thermus aquaticus),因此被稱為Taq。Taq酶被廣泛用于�(dāng)前的PCR操作中。Taq酶的缺點(diǎn)是它缺少3'->5'校正外切酶活�,因此在�(fù)制DNA�(shí)有時(shí)�(huì)出錯(cuò),造成DNA序列突變(�(cuò)�)。從古菌中獲得的Pwo酶及Pfu酶均有校正機(jī)�,能夠大大降低PCR反應(yīng)中的突變。將Taq與Pfu�(jié)合使用可以保證真�(shí)�(zhǔn)確得�(kuò)增DNA�


操作�(guò)�

    PCR用于�(kuò)增一小段已知的DNA片斷,可能是單�(gè)基因,或者僅僅是某�(gè)基因的一部分。與活體生物不同的是,PCR只能�(fù)制很短的DNA片斷,通常�10kbp。DNA是雙鏈分�,因此用互補(bǔ)DNA雙鏈的構(gòu)造單�(核苷�)�(lái)度量其大�,單位為堿基�(duì)(base pair, bp)。某些特定的方法可以�(kuò)�40kbp左右的片�,但是這種大小與真核細(xì)胞的染色體DNA相比仍然是很少的。例�,人的體�(xì)胞DNA含有大約30億�(gè)堿基�(duì)� 目前�(yīng)用的PCR反應(yīng)需要幾�(gè)基本組成�

    DNA模板(template�,含有需要擴(kuò)增的DNA片斷�

    2�(gè)引物(primer),決定了需要擴(kuò)增的起始和終止位�。(�(jiàn)下面引物一節(jié)�

    DNA聚合酶(polymerase�,復(fù)制需要擴(kuò)增的區(qū)域�

    脫氧單核苷酸(dNTP),用于�(gòu)造新的互�(bǔ)��

    緩沖體系,提供適合聚合酶行使功能的化�(xué)�(huán)境�

    PCR反應(yīng)在熱循環(huán)�(shè)備中�(jìn)�。PCR儀可以將反�(yīng)管加熱或冷卻到每步反�(yīng)所需的的溫度。為防止反應(yīng)體系中液體產(chǎn)生蒸�,通常在反�(yīng)管上加蓋加熱的蓋�(�加熱�溫度�(lái)的高),或者在反應(yīng)體系表面加入一層石蠟油�


步驟

    一般的PCR反應(yīng)�20�35�(gè)循環(huán)組成,每�(gè)循環(huán)包括以下3�(gè)步驟:

    利用高溫(93-98�)使雙鏈DNA分離(熔解)。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一�(gè)循環(huán)之前,通常加熱�(zhǎng)一些時(shí)間以確保模板和引物完全分�,僅以單鏈形式存�。該步驟�(shí)�1-2分鐘�

    在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以�(jié)合于單鏈DNA�(降溫或稱接合)。此階段的溫度通常低于引子熔點(diǎn)5�。錯(cuò)誤的黏合溫度可能�(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯(cuò)誤地�(jié)�。該步驟�(shí)�1-2分鐘。新技�(shù)的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度�(huì)高于熔點(diǎn)3~5�,僅需�(shí)�5~10秒�

    最后,DNA聚合酶由降溫�(shí)�(jié)合上的引子開(kāi)始沿著DNA鏈合成互�(bǔ)�(延長(zhǎng))。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟�(shí)間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片斷�(zhǎng)�。傳�(tǒng)的Taq估計(jì)合成1000bp大概需�1分鐘、較新的Tbr(�(lái)自于嗜熱菌Thermus brockianus)�40�、融合型聚合酶僅�15��


PCR的應(yīng)�

    基因圖譜建立

    親子鑒定

    偵測(cè)遺傳疾病

    克隆基因

    基因突變研究

    DNA遺傳演化

    基因表現(xiàn)比較


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