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變性梯度凝膠電�
閱讀�1242�(shí)間:2022-03-16 14:15:35

    變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)最初是Lerman 等人�20 世紀(jì)80 年代初期�(fā)明的,起初主要用來檢測DNA 片段中的�(diǎn)突變。Muyzer 等人�1993 年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)�(gòu)研究 。后來又�(fā)展出其衍生技�(shù),溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)。此后十年間,該技�(shù)被廣泛用于微生物分子生態(tài)�(xué)研究的各�(gè)�(lǐng)�,目前已�(jīng)�(fā)展成為研究微生物群落�(jié)�(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一�

基本�(nèi)�

    原理如下:雙鏈DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí),其遷移行為決定于其分子大小和電�。不同長度的DNA 片段能夠被區(qū)分開,但同樣長度的DNA 片段在膠中的遷移行為一�,因此不能被區(qū)�。DGGE/TGGE 技�(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基�(chǔ)�,加入了變性劑(尿素和甲酰胺)梯度,從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA 片段區(qū)分開�。一�(gè)特定的DNA 片段有其特有的序列組成,其序列組成決定了其解鏈區(qū)�(meltingdomain, MD)和解鏈行�(melting behavior) 。一�(gè)幾百�(gè)堿基對的DNA 片段一般有幾�(gè)解鏈區(qū)域,每�(gè)解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對組成(圖1�。當(dāng)變性劑濃度逐漸增加�(dá)到其低的解鏈區(qū)域濃度時(shí),該區(qū)域這一段連續(xù)的堿基對�(fā)生解�。當(dāng)濃度度再升高依次�(dá)到各其他解鏈區(qū)域濃度時(shí),這些區(qū)域也依次�(fā)生解�。直到變性劑濃度�(dá)到高的解鏈區(qū)域濃度后,高的解鏈區(qū)域也�(fā)生解�,從而雙鏈DNA 完全解鏈�

    不同的雙鏈DNA 片段�?yàn)槠湫蛄薪M成不一�,所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈濃度也是不一樣的。當(dāng)它們�(jìn)行DGGE�(shí),一開始變性劑濃度比較�,不能使雙鏈DNA 片段低的解鏈區(qū)域解�,此�(shí)DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰

    胺凝膠中一�。然而一旦DNA 片段遷移到一特定位置,其變性劑濃度剛好能使雙鏈DNA 片段低的解鏈區(qū)域解鏈時(shí),雙鏈DNA 片段低的解鏈區(qū)域立即發(fā)生解�。部分解鏈的DNA 片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因�,同樣長度但序列不同的DNA 片段會在膠中不同位置處達(dá)到各自低解鏈區(qū)域的解鏈濃度,因此它們會在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降,從而在膠中被區(qū)分開�。然�,一旦變性劑濃度�(dá)到DNA 片段高的解鏈區(qū)域溫度時(shí),DNA 片段會完全解�,成為單鏈DNA 分子,此�(shí)它們又能在膠中繼續(xù)遷移。因此如果不同DNA 片段的序列差異發(fā)生在高的解鏈區(qū)域時(shí),這些片段就不能被區(qū)分開�。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段(GC 夾子,一�30-50 �(gè)堿基對)可以解決這�(gè)問題。含有GC 夾子的DNA 片段高的解鏈區(qū)域在GC 夾子這一段序列處,它的解鏈濃度很�,可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC 夾子后,DNA 片段中基本上每�(gè)堿基處的序列差異都能被區(qū)分開�


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