離子淌度�(zhì)譜是離子淌度分離與質(zhì)譜聯(lián)用的一種新型二維質(zhì)譜分析技�(shù),離子淌度分離原理是基于離子在飄移管中與緩沖氣體碰撞時的碰撞截面不同,離子可按大小和形狀進行分離。經(jīng)�30多年的發(fā)�,離子淌度質(zhì)譜已配有多種的離子源及質(zhì)量分析器,理論研究也日漸成熟,并在蛋白質(zhì)、多肽及�(fù)雜化合物異構(gòu)體分析方面越�(fā)顯示出獨特的�(yōu)�,正在發(fā)展成為一種新型的重要分析工具�
IMMS基本原理
離子淌度(ionmobility,IM),又稱離子遷移率,是指在電場強度�1V/m或電場力�1N時正離子或負(fù)離子的運動速度,單位為m/V。在IMS中,離子受電場力加速的作用向前運動,運動中又與飄移區(qū)緩沖氣體分子�(fā)生碰撞產(chǎn)生阻力使速度降低。碰撞過程中離子失去的動能可�(zhuǎn)化為�(nèi)能使離子溫度升高,再次的碰撞又可將升高的�(nèi)能傳遞給氣體分子,回�(fù)到系�(tǒng)溫度。因�,離子在運動過程中溫度和速度并不保持恒定。離子之�、離子與緩沖氣體之間也可能存在著靜電引力與庫侖斥力,決定了離子在飄移區(qū)的運動過程是極其�(fù)雜的,只能由其平均速度(即離子淌�)或離子通過飄移區(qū)的時間td來計�。這種分離過程與色譜的分離過程類似,因此IMS在早期又被稱為等離子體色�(plasmachromatography,Pc)。為了使不同實驗條件下的測量值能夠相互比�,在實際�(yīng)用中通常將離子淌度轉(zhuǎn)換為折合離子淌度(reducedionmobility�),即在溫度為273K,壓力為760Tort的條件下的離子淌�,離子的大小和形狀可用離子與緩沖氣體發(fā)生碰撞時的平均可用截面即碰撞截面(collisionCrosssection,n)來衡�。由上述可知,離子淌度分離主要是基于離子的形狀和大�。因�,對于用常規(guī)�(zhì)譜方法不能區(qū)分的異構(gòu)體或�(fù)合物等分析,這種分離手段具有獨特�(yōu)�。離子按淌度�(yù)分離�,再通過每一組分�(zhì)荷比求得�(zhì)量數(shù),便可獲得離子淌度質(zhì)譜二維圖譜或三維圖譜(�1)�
儀器組�
離子淌度�(zhì)譜儀與常�(guī)�(zhì)譜儀的主要區(qū)別在于前者在離子源和�(zhì)量分析器之間增加了一個離子飄移管。離子飄移管通常由不�(dǎo)電的高純度氧化鋁制成,中間鑲嵌若干不銹鋼�(huán),不銹鋼�(huán)之間以高溫電阻相�,兩端不銹鋼�(huán)之間施加�(qū)動離子前進的電場。質(zhì)量分析器可采用四極質(zhì)量分析器或飛行時間質(zhì)量分析器,由于四極分析器掃描離子費時較長,現(xiàn)在IMMS分析器多為飛行時間質(zhì)�(TOF—MS)。儀器中飄移管部分通以緩沖氣體,質(zhì)量分析器部分采用高真�,二者之間配以由錐體和離子透鏡組成的接�。典型的離子淌度�(zhì)譜的組成見圖2。由于離子在飄移管中通過的時間為毫秒�,在飛行管中通過時間為微秒級,在下一組分到來前有充足的時間求得離子的�(zhì)量數(shù),因此對每一組分可在一次實驗中同時求得淌度和質(zhì)量數(shù),整個實驗可�1min�(nèi)完成�
有時為了獲得更多的離子信�,可在飄移管前和(�)后串�(lián)使用幾種�(zhì)量分析器,如離子阱或四極濾質(zhì)器等�
緩沖氣體對碰撞截面的影響
IMS區(qū)分離子是通過與緩沖氣體分子碰撞過程而實�(xiàn)的,緩沖氣體的種類直接影響分離過程。氮氣和氦氣是最常用的兩種氣�,氮氣一般用于常�(guī)分析,氦氣常用于�(jié)�(gòu)分析。其他氣體還有二氧化碳、六氟化�、氨和四氟化�。使用不同緩沖氣體的理論研究�1975年之后便很少,即使是�(xiàn)在也還沒有引起人們足夠的重視,但在實際應(yīng)用中,使用不同的氣體對獲得良好的分辨率和檢測靈敏度相�(dāng)重要�
離子的碰撞截面不僅與緩沖氣體的質(zhì)量數(shù)有關(guān),而且取決于緩沖氣體極化率的大小。Matz等研�6種苯丙胺(安非他明)衍生物在氦氣、氬氣、氮氣與二氧化碳4種不同緩沖氣體下的碰撞截�,結(jié)果顯示碰撞截面隨緩沖氣體�(zhì)量數(shù)的上升而上�,但并無�(yán)格的線性關(guān)系。而極化率與碰撞截面之間有良好的線性關(guān)�,碰撞截面隨極化率的上升而上升,這也說明碰撞截面更依賴于緩沖氣體的極化率而不是質(zhì)量數(shù)。Els等研究了不同濃度的氮�/二氧化碳混合氣體作為緩沖氣體在l0水平分離5種氯代和溴代乙酸的情�,使�100%氮氣�2種組分淹沒在其他峰中,若在緩沖氣體中加入3%二氧化碳,則能達到完全分�,表明載氣的組成明顯影響峰形的檢��
離子淌度與質(zhì)荷比的關(guān)�
IMS分辨率較低,即使是高分辨IMS也只能達到與常規(guī)HPLC相同或稍高的分辨能力,這使其單獨分離復(fù)雜混合物變得困難。在IMS�(fā)明之初,研究者就試圖通過建立與m/z的關(guān)�,由推知離子的質(zhì)量數(shù)。但大量實驗�(shù)�(jù)表明,與m/z之間只是一種粗略的線性趨�,遠遠不能滿足人們對離子�(zhì)量數(shù)的精確要�,IMS在質(zhì)荷比(m/z)
IMMS中只能作為一種前�(zhì)量分析器。盡管有的物�(zhì)能夠通過單一的離子淌度技�(shù)快速鑒別開�,但IMMS能夠提供的二維“淌�/�(zhì)量”模式能夠達到對�(fù)雜混合物的高分辨分離。在二維IMMS(2-DIMMS)�,不同電荷的離子其“淌�/�(zhì)量”線性趨勢明顯不同,通過對復(fù)雜產(chǎn)物的2-D�(shù)�(jù)進行分析,找出其不同的“淌�/�(zhì)量”關(guān)系已�(jīng)成為鑒定和解釋這些�(chǎn)物的一種重要技�(shù)。Clemmer等已�(jīng)通過與m/z趨勢�(guān)系鑒別了低淌�(單電�)和高淌度(雙電�)的兩組肽混合物J。Russel等使用內(nèi)�(biāo)作為參照�(biāo)�(zhǔn),根�(jù)與m/z�(guān)系將蛋白�(zhì)酶解后的肽混合物分開。Stciner利用ESI—API—IM—TOF—MS分析水溶性化�(xué)�(zhàn)劑降解產(chǎn)�,使用相同系列的n一烷基胺作為基線標(biāo)�(zhǔn),利用不同降解產(chǎn)物的與m/z趨勢使其得到鑒定�
離子淌度的測定受各種因素的影�,如電噴霧溶劑組成、飄移區(qū)溫度、噴霧電�、溶劑流速、緩沖氣體流�、冷卻氣體流速等諸多因素影響�
離子電荷、取代基與碰撞截面的�(guān)�
盡管還沒有方法證明氣相離子和溶液中離子的�(jié)�(gòu)之間有如何緊密的�(guān)�,但精確測量離子的碰撞截面還是能提高對肽、蛋白質(zhì)等復(fù)雜物�(zhì)�(jié)�(gòu)的理解。離子中原子間氫鍵和范德華力使其呈現(xiàn)折疊和緊湊狀�(tài),電荷和庫侖斥力則克服離子內(nèi)的相互吸引而使分子呈現(xiàn)松散狀�(tài)。Kindy等利用同位素�(biāo)記研究了3種蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物,�(fā)�(xiàn)單乙?;亩蔚呐鲎步孛姹任匆阴;囊叱?5%�35%;雙乙酰化的增加更多,這種增加(特別對大的肽�)遠遠大于�?;捏w積增大因素,表明�?;哂袑﹄碾x子整體結(jié)�(gòu)改變的特殊作�。Badman等叫研究了泛素從ESI進入IM管過程中碰撞截面的變化過�,認(rèn)為離子進入飄移管的初期均為緊湊�(jié)�(gòu),受加速電壓的作用才快速伸展成開放�(jié)�(gòu)�
離子中電荷的位置和數(shù)量是影響氣相離子碰撞截面的重要參�(shù)。Wu等研究了強啡肽A�3個片段F7(Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu—Arg—Arg)、F8(Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu—Arg—Arg一Ⅱe)、F�9(Tyr—Gly—Gly—Phe—Leu—Arg—Arg—He—Arg)�1�3個電荷時的碰撞截面變化情況,�(jié)果見�1。單電荷和雙電荷的碰撞截面從F7至F�9增加值穩(wěn)定在�9%,這可用在C端增加一個氨基酸的“大小效果”很好地解釋。另外,所�3種肽從單電荷到雙電荷碰撞截面的增加都保持在相似的7%一8%水平。隨著電荷的增加,庫侖斥力增加使肽呈�(xiàn)更松散狀�(tài)。然�,在F7和F8中引入第3個電�,卻使碰撞截面急劇上升,這是因為在這些肽中只存�3個堿性位�,相鄰的兩個精氨酸殘基必須同時�(zhì)子化,急劇增加的庫侖斥力能使得離子以一種更加伸展的狀�(tài)存在,而使碰撞截面急劇增加。F�9離子增加不顯著是因為末端精氨酸殘基的存在可以避免兩個相鄰氨基酸均被�(zhì)子化。Badman等總�(jié)�1996�2001年間�(fā)表的細胞色素e氣態(tài)離子碰撞截面的數(shù)�(jù),所帶電荷從+3�+20,雖然同電荷離子的碰撞截面數(shù)值稍有不�,但均表�(xiàn)為隨電荷的增加而增加,增加幅度也極為相��
利用碰撞截面�(yōu)越性的地方在于區(qū)別具有相同電�、相似質(zhì)量的不同離子或質(zhì)量數(shù)相同的異�(gòu)體離�。Hen.derson等研究了細胞色素c兩個酶解碎片IFVQK.CAQCHTVEK(相對分子�(zhì)量為1633�820)和heme.CAQCHTVEK(相對分子�(zhì)量為1633�615),二者具有極為相似的�(zhì)量數(shù),在序列已知的情況下,利用軟件模擬其電荷分布情況,分別計算其所需的碰撞截面和加速電�,測量其離子淌度,求出碰撞截面并與計算值相比較,從而區(qū)分兩種碎�,結(jié)果顯示兩個碎片均帶兩個電�,分別為IrVQK—CAQCHTVEK和heme—C“AQCHTVEK(上標(biāo)為質(zhì)子化位置)�
文獻[35]列出�34種常見蛋白質(zhì)酶解后的660種肽離子的碰撞截面數(shù)�(jù),并從統(tǒng)計學(xué)角度在理論上分析了氨基酸殘基的內(nèi)在形狀參數(shù)與碰撞截面的�(guān)�,從而可通過氨基酸序列預(yù)測肽離子的碰撞截��
�(zhì)譜技�(shù)是當(dāng)今分析化�(xué)�(lǐng)域最重要的技�(shù)之一。離子淌度質(zhì)譜結(jié)合了離子淌度技�(shù)靈敏、快�、能夠提供離子結(jié)�(gòu)信息和質(zhì)譜能夠提供準(zhǔn)確質(zhì)量信息的特點,在化合物異�(gòu)體分�、生物大分子相互作用分析等方面正顯示出越來越多的�(yōu)越�。目前國�(nèi)有關(guān)離子淌度�(zhì)譜的報道很少,國外也僅有為數(shù)不多的科研機�(gòu)進行離子淌度�(zhì)譜的研究。目前離子淌度質(zhì)譜儀還沒有上�,還有一些需要解決的問題,但�(jīng)�30多年的發(fā)�,其理論研究已近成熟,儀器已配備了MALDI和ESI等新型離子源,有些還同時串聯(lián)了四極桿�(zhì)譜和(�)離子阱質(zhì)�,具有更低的檢測限和更高的靈敏度和分辨率??梢韵嘈牛诓痪玫膶�?,離子淌度質(zhì)譜會成為功能基因�、蛋白質(zhì)組學(xué)研究,以及藥�(xué)、醫(yī)�(xué)和化工等�(lǐng)域不可缺少的重要工具�
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