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高效液相色譜
閱讀�3933時間�2018-05-30 10:10:03

高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography \ HPLC)又稱“高壓液相色譜�、“高速液相色譜�、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分�,以液體為流動相,采用高壓輸液系�(tǒng),將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜�,在柱內(nèi)各成分被分離�,�(jìn)入檢測器�(jìn)行檢�,從而實(shí)�(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化�(xué)、醫(yī)�(xué)、工�(yè)、農(nóng)�(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技�(shù)�(yīng)��

歷史

  1903年俄國植物化�(xué)家茨維特(Tswett)首次提出“色譜法”(Chromatography)和“色譜圖”(Chromatogram)的概念。茨維特使用色譜法chromatography(來自希臘字,chroma意思是顏色,graphy意思是記錄-直譯為顏色記錄)來描述他的彩色試�(yàn)。(令人好奇的是,俄羅斯名字茨維特意思是顏色。)他在論文中寫到:
  “(原文)一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加�,沿管濾�,后用純石油醚淋洗,�(jié)果按照不同色素的吸附順序在管�(nèi)觀察到它們相�(yīng)的色�,就象光譜一樣,稱之為色譜圖。�
  1930年以�,相繼出�(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技�(shù)�
  1952年,英國�(xué)者M(jìn)artin和Synge基于他們在分配色譜方面的研究工�,提出了�(guān)于氣-液分配色譜的比較完整的理論和方�,把色譜技�(shù)向前推�(jìn)了一大步,這是氣相色譜在此后的十多年間�(fā)展十分迅速的原因�
  1958�,基于Moore和Stein的工�,離子交換色譜的儀器化�(dǎo)致了氨基酸分析儀的出�(xiàn),這是近代液相色譜的一個重要嘗�,但分離效率尚不理想�
  1960年中后期,氣相色譜理論和�(shí)踐發(fā)展,以及�(jī)�、光�(xué)、電子等技�(shù)上的�(jìn)�,液相色譜又開始活躍。到60年代末期把高壓泵和化�(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC�
  1970年中期以�,微處理�(jī)技�(shù)用于液相色譜,�(jìn)一步提高了儀器的自動化水平和分析精度�
  1990年以�,生物工程和生命科學(xué)在國際和國內(nèi)的迅速發(fā)�,為高效液相色譜技�(shù)提出了更多、更新的分離、純�、制備的課題,如人類基因組計�,蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)分離��

特點(diǎn)

  高效液相色譜法有“四高一廣”的特點(diǎn)�
  ①高壓:流動相為液體,流�(jīng)色譜柱時,受到的阻力較大,為了能迅速通過色譜柱,必須對載液加高壓�
  ②高速:分析速度�、載液流速快,較�(jīng)典液體色譜法速度快得多,通常分析一個樣品在15�30分鐘,有些樣品甚至在5分鐘�(nèi)即可完成,一般小�1小時�
  ③高效:分離效能�。可選擇固定相和流動相以�(dá)到分離效�,比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍�
 ?、芨哽`敏度:紫外檢測器可達(dá)0.01ng,�(jìn)樣量在μL�(shù)量級�
 ?、輵?yīng)用范圍廣:百分之七十以上的有�(jī)化合物可用高效液相色譜分�,特別是高沸�(diǎn)、大分子、強(qiáng)極�、熱�(wěn)定性差化合物的分離分析,顯示出�(yōu)勀�
 ?、拗涌煞磸?fù)使用:用一根柱子可分離不同化合�
  ⑦樣品量�、容易回收:樣品�(jīng)過色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備�
  此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破�、易回收等優(yōu)�(diǎn),但也有缺點(diǎn),與氣相色譜相比各有所長,相互�(bǔ)�。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效�(yīng)�。在從�(jìn)樣到檢測器之�,除了柱子以外的任何死空間(�(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等)中,如果流動相的流型有變化,被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加�,柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜�

類型

  1、吸附色譜法(Adsorption Chromatography)
  2、分配色譜法(Partition Chromatography)
  3、離子色譜法(Ion Chromatography)
  4、分子排阻色譜法/凝膠色譜�(Size Exclusion Chromatography)
  5、鍵合相色譜法(bonded-phase chromatography�
  6、親和色譜法(Affinity Chromatography)

�(jié)�(gòu)

  組成
  可分為“高壓輸液泵�、“色譜柱�、“�(jìn)樣器�、“檢測器”、“餾分收集器”以及“數(shù)�(jù)獲取與處理系�(tǒng)”等部分�
  技�(shù)動態(tài)
  液相色譜和質(zhì)譜連接,可以增加額外的分析能力,能夠準(zhǔn)確鑒定和定量像細(xì)胞和組織裂解�,血�,血漿,尿液和口腔液等復(fù)雜樣品基�(zhì)中的微量化合�。高效液相色譜質(zhì)譜系�(tǒng)(ABSciexEksigentLC/MS和LC/MS/MS)提供了一些獨(dú)特的�(yōu)勢,包括�
  快速分析和流轉(zhuǎn)所需的最少樣品準(zhǔn)�
  高靈敏度并結(jié)合可分析多個化合物能力,甚至可以跨越化合物的種�
  高精確度,高分辨率鑒定和量化目標(biāo)分析�
  高壓輸液�
  功能
  �(qū)動流動相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統(tǒng)�
  性能要求
  流量�(wěn)定(±1),耐高�(30�60Mpa),耐各種流動相:例如:有機(jī)溶劑、水和緩沖液�
  種類
  往�(fù)泵和隔膜��
  色譜�
  功能
  分離樣品中的各個物�(zhì)�
  尺寸
  10�30cm��2�5mm�(nèi)徑的�(nèi)壁拋光的不銹鋼管柱;
  填料粒度
  5�10μm,高效微粒固定相�
  �(jìn)樣器
  功能
  將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)�
  種類
  ①注射器�10Mpa以下�1�10μm微量注射器�(jìn)�
  ②停流�(jìn)�
 ?、坶y�(jìn)�,常�、較理想、體積可�,可固定
  ④自動�(jìn)樣器,有利于重復(fù)操作,實(shí)�(xiàn)自動�
  檢測�
  功能
  將被分析組在柱流出液中濃度的變化�(zhuǎn)化為光學(xué)或電�(xué)信號�
  分類
 ?、偈静钫酃饣瘜W(xué)檢測�
  ②紫外吸收檢測器
 ?、圩�?可見分光光度檢測�
 ?、芏O管陣列紫外檢測器
 ?、轃晒鈾z測器
 ?、揠娀瘜W(xué)檢測�
  餾分收集�
  功能
  如果所�(jìn)行的色譜分離不是為了純粹的色譜分�,而是為了做其它波譜鑒�,或獲取少量試驗(yàn)樣品的小型制備,餾分收集是必要的�
  方法
 ?、偈�?,少�(shù)幾個餾�,手�(xù)麻煩,易出差錯�
 ?、陴s分收集器收集,比較理�,微�(jī)控制操作�(zhǔn)��
  �(shù)�(jù)
  獲取與處理功�
  把檢測器檢測到的信號顯示出來�

分離原理

  �-液分�
  (Liquid-liquidPartitionChromatography)及化�(xué)鍵合相色�(ChemicallyBondedPhaseChromatography) 流動相和固定相都是液�。流動相與固定相之間�(yīng)互不相溶(極性不同,避免固定液流失),有一個明顯的分界�。當(dāng)試樣�(jìn)入色譜柱,溶�(zhì)在兩相間�(jìn)行分�。達(dá)到平衡時,服從于高效液相色譜計算公式�
  式中,cs—溶�(zhì)在固定相中濃�;cm—溶�(zhì)在流動相中的濃度;Vs—固定相的體�;Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之�,即分離的順序取決于K,K大的組分保留值大;但也有不同之處,GPC�,流動相對K影響不大,LLPC流動相對K影響較大�
  a.正相�-液分配色譜法(NormalPhaseliquidChromatography):流動相的極性小于固定液的極��
  b.反相�-液分配色譜法(ReversePhaseliquidChromatography):流動相的極性大于固定液的極��
  c.�-液分配色譜法的缺�(diǎn):盡管流動相與固定相的極性要求完全不同,但固定液在流動相中仍有微量溶�;流動相通過色譜柱時的機(jī)械沖擊力,會造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相(見后�,可克服上述缺點(diǎn)�
  液—固
  流動相為液體,固定相為吸附劑(如硅膠、氧化鋁等)。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來�(jìn)行分離的。其作用�(jī)制是:當(dāng)試樣�(jìn)入色譜柱�,溶�(zhì)分子(X)和溶劑分�(S)對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附(未�(jìn)樣時,所有的吸附劑活性中心吸附的是S),可表示如下:XmnSa======XanSm
  式中:Xm--流動相中的溶�(zhì)分子;Sa--固定相中的溶劑分子;Xa--固定相中的溶�(zhì)分子;Sm--流動相中的溶劑分��
  �(dāng)吸附競爭反應(yīng)�(dá)平衡時:
  K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
  式中:K為吸附平衡常�(shù)。[討論:K越大,保留值越�。]
  離子交換
  (Ion-exchangeChromatography)
  IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流
  動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子�(jìn)行可逆交�,依�(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分雀以陰離子交換劑為例,其交換過程可表示如下:
  X-(溶劑中�(樹脂-R4NCl-)===(樹�-R4NX-)Cl-(溶劑中�
  �(dāng)交換�(dá)平衡時:
  KX=[-R4NX-][Cl-]/[-R4NCl-][X-]
  分配系數(shù)為:
  DX=[-R4NX-]/[X-]=KX[-R4NCl-]/[Cl-]
  [討論:DX與保留值的�(guān)系]
  凡是在溶劑中能夠電離的物�(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來�(jìn)行分��
  離子�
  (IonPairChromatography)
  離子對色譜法是將一�(或多�)與溶�(zhì)分子電荷相反的離�(稱為對離子或反離�)加到流動相或固定相中,使其與溶質(zhì)離子�(jié)合形成疏水型離子對化合物,從而控制溶�(zhì)離子的保留行為。其�
  離子色譜儀流程示意
  離子色譜儀流程示意
  理可用下式表示:X水相Y-水相===XY-有機(jī)�
  式中:X水相--流動相中待分離的有機(jī)離子(也可是陽離子);Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對(如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等�;XY---形成的離子對化合��
  �(dāng)�(dá)平衡時:
  KXY=[XY-]有機(jī)�/[X]水相[Y-]水相
  根據(jù)定義,分配系�(shù)為:
  DX=[XY-]有機(jī)�/[X]水相=KXY[Y-]水相
  [討論:DX與保留值的�(guān)系]
  離子對色譜法(特別是反相)解決了以往難以分離的混合物的分離問�,諸如酸、堿和離�、非離子混合�,特別是一些生化試樣如核酸、核�、生物堿以及藥物等分雀�
  離子
  (IonChromatography)
  用離子交換樹脂為固定�,電解質(zhì)溶液為流動相。以電導(dǎo)檢測器為通用檢測�,為消除流動相中�(qiáng)電解�(zhì)背景離子對電�(dǎo)檢測器的干擾,設(shè)置了抑制�。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反�(yīng)原理與離子交換色譜法相同�
  以陰離子交換樹脂(R-OH)作固定相,分離陰離子(如Br-)為�。當(dāng)待測陰離子Br-隨流動相(NaOH)�(jìn)入色譜柱�,發(fā)生如下交換反�(yīng)(洗脫反�(yīng)為交換反�(yīng)的逆過程)�
  抑制柱上�(fā)生的反應(yīng)�
  R-HNaOH-===R-NaH2O
  R-HNaBr-===R-NaHBr-
  可見,通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電�(dǎo)值很小的水,消除了本底電�(dǎo)的影�;試樣陰離子Br-則被�(zhuǎn)化成了相�(yīng)的酸HBr-,可用電�(dǎo)法靈敏的檢測�
  離子色譜法是溶液中陰離子分析的方�。也可用于陽離子分析�
  空間排阻
  (StericExclusionChromatography)
  空間排阻色譜法以凝膠(gel)為固定相。它類似于分子篩的作�,但凝膠的孔徑比分子篩要大得�,一般為�(shù)納米到數(shù)百納米。溶�(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來�(jìn)行分�,而是按分子大小�(jìn)行分�。分離只與凝膠的孔徑分布和溶�(zhì)的流動力�(xué)體積或分子大小有�(guān)。試樣�(jìn)入色譜柱�,隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流�。在試樣中一些太大的分子不能�(jìn)入膠孔而受到排�,因此就直接通過柱子,首先在色譜圖上出現(xiàn),一些很小的分子可以�(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒�,這些組分在柱上的保留�,在色譜圖上出現(xiàn)�

相關(guān)�(shù)�

  色譜�(chromatogram)——樣品流�(jīng)色譜柱和檢測�,所得到的信�-時間曲線,又稱色譜流出曲�(elution profile)�
  基線(base line)——經(jīng)流動相沖�,柱與流動相�(dá)到平衡后,檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時間軸�
  噪音(noise)——基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)�、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所��
  漂移(drift)——基線隨時間的緩緩變�。主要由于操作條件如電壓、溫�、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起,柱�(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂��
  色譜�(peak)——組分流�(jīng)檢測器時響應(yīng)的連續(xù)信號�(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線(高斯Gauss曲線�。不對稱色譜峰有兩種�
  前延�(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少��
  峰底—基線上峰的起點(diǎn)至終�(diǎn)的距��
  峰高(peak height,h)—峰的點(diǎn)至峰底的距離�
  峰寬(peak width,W)—峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個交�(diǎn)間的距離。W=4σ
  半峰寬(peak width at half-height,Wh/2)—峰高一半處的峰�。Wh/2=2.355σ
  峰面�(peak area,A)—峰與峰底所包圍的面積�
  保留時間(retention time,tR)——從�(jìn)樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間�
  理論塔板�(shù)(theoretical plate number,N)——用于定量表示色譜柱的分離效率(簡稱柱效��
  分離�(resolution,R)——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比�。也叫分辨率,表示相鄰兩峰的分離程度。R�1.5稱為完全分離�
  《中國藥典》規(guī)定R�(yīng)大于1.5�
  拖尾因子(tailing factor,T)——T=,用以衡量色譜峰的對稱�。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)�
  《中國藥典》規(guī)定T�(yīng)�0.95~1.05�
  T1.05為拖尾峰�

色譜�

  填料和流動相的組�
  �(yīng)按各品種�(xiàng)下的�(guī)�,常用的色譜柱填料有硅膠和化�(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用辛基鍵合硅膠次�,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用;離子交換填料用于離子交換色�;凝膠或玻璃微球�,用于分子排阻色譜等。注樣量一般為�(shù)微升。除另有�(guī)定外,柱溫為室溫,檢測器為紫外吸收檢測器�
  在用紫外吸收檢測器時,所用流動相�(yīng)符合紫外分光光度法項(xiàng)下對溶劑的要求�
  正文中各品種�(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變�,其余如色譜柱內(nèi)�、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流�、混合流動相各組分的比例、柱�、�(jìn)樣量、檢測器的靈敏度�,均可適�(dāng)改變�
  以適�(yīng)具體品種并達(dá)到系�(tǒng)適用性試�(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘�(nèi)記錄完畢�
  系統(tǒng)適用�
  按各品種�(xiàng)下要求對儀器�(jìn)行適用性試�(yàn),即用規(guī)定的對照品對儀器�(jìn)行試�(yàn)和調(diào)�,應(yīng)�(dá)到規(guī)定的要求;或�(guī)定分析狀�(tài)下色譜柱的最小理論板�(shù)、分離度和拖尾因�.
  色譜�
  在選定的條件�,注入供試品溶液或各品種�(xiàng)下規(guī)定的�(nèi)�(biāo)物質(zhì)溶液,記錄色�,量出供試品主成分或�(nèi)�(biāo)物質(zhì)峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2),按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數(shù),如果測得理論板�(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板�(shù),應(yīng)改變色譜柱的某些條件(如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等�,使理論板數(shù)�(dá)到要求�
  分離�
  定量分析�,為便于�(zhǔn)確測�,要求定量峰與其他峰或內(nèi)�(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度(R)的計算公式為:R=2(tR2-tR1)/(W1+W2),式中t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時間;t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間;W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。除另外有規(guī)定外,分離度�(yīng)大于1.5�
  拖尾因子
  為保證測量精�,特別當(dāng)采用峰高法測量時,應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項(xiàng)下的�(guī)定或不同濃度�(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為�
  T(拖尾因子)=W0.05h/2d1式中W(0.05h)�0.05峰高處的峰寬�
  d1為峰極大至峰前沿之間的距�。除另有�(guī)定外,T�(yīng)�0.95�1.05��
  也可按各品種校正因子測定�(xiàng)�,配制相�(dāng)�80%�100%�120%的對照品溶液,加入規(guī)定量的內(nèi)�(biāo)溶液,配成三種不同濃度的溶液,分別注�3�,計算平均校正因�,其相對�(biāo)�(zhǔn)偏差�(yīng)不大�2.0%�

測定

  定量測定時,可根�(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高�。但用歸一法或�(nèi)�(biāo)法測定雜�(zhì)總量�,須采用峰面積法�
  面積歸一化法
  測定供試品(或經(jīng)衍生化處理的供試品)中各雜質(zhì)及雜�(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一�。計算各雜質(zhì)峰面積及其總�,并求出占總峰面積的百分�。但溶劑峰不計算在內(nèi)。色譜圖的記錄時間應(yīng)根據(jù)各品種所含雜�(zhì)的保留時間決�,除另有�(guī)定外可為該品種項(xiàng)下主成分保留時間的倍數(shù)�
  主成分自身對照法
  �(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時,采用主成分自身對照法。在測定�,先按各品種�(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度,將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液,�(jìn)�,調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度或�(jìn)樣量,使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足�(zhǔn)確測量要�。然后取供試品溶�,�(jìn)�,記錄時�,除另有�(guī)定外,應(yīng)為主成分保留時間的倍數(shù)。根�(jù)測得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對照溶液主成分的峰面積比較,計算雜�(zhì)限度�
  �(nèi)�(biāo)法 測定供試品中雜質(zhì)的總量限�
  采用不加校正因子的峰面積法。取供試�,按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制不含�(nèi)�(biāo)物質(zhì)的供試品溶液,注入儀�,記錄色譜圖�;再配制含有�(nèi)�(biāo)物質(zhì)的供試品溶液,在同樣的條件下注樣,記錄色譜圖�。記錄的時間除另有規(guī)定外,應(yīng)為該品種�(xiàng)下規(guī)定的�(nèi)�(biāo)峰保留時間的倍數(shù),色譜圖上內(nèi)�(biāo)峰高�(yīng)為記錄儀滿標(biāo)度的30%以上,否則應(yīng)�(diào)整注樣量或檢測器靈敏��
  如果色譜圖Ⅰ中沒有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)�(biāo)峰保留時間相同的雜質(zhì)�,則色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰面積之和應(yīng)小于�(nèi)�(biāo)物質(zhì)峰面積(溶劑峰不計在�(nèi)�。如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)�(biāo)物質(zhì)峰保留時間相同的雜質(zhì)�,應(yīng)將色譜圖Ⅱ上的內(nèi)�(biāo)物質(zhì)峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜�(zhì)峰面�,即為內(nèi)�(biāo)物質(zhì)峰的校正面積;色譜圖Ⅱ中各雜�(zhì)峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面�,即為各雜質(zhì)峰的校正總面�,各雜質(zhì)峰的校正總面積應(yīng)小于�(nèi)�(biāo)物質(zhì)峰的校正面積�
  加校正因子測定供試品主成分含�
  按各品種�(xiàng)下的�(guī)定,精密稱(量)取對照品和內(nèi)�(biāo)物質(zhì),分別配成溶�,精密量取各溶液,配成校正因子測定用的對照溶�,取一定量注入儀器,記錄色譜�,測量對照品和內(nèi)�(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高,按下式計算校正因子:
  As/ms]校正因子f=-Ar/mr式中As為內(nèi)�(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰�,Ar為對照品的峰面積或峰�;ms為加入內(nèi)�(biāo)物質(zhì)的量mr為加入對照品的量。再取各品種�(xiàng)下含有內(nèi)�(biāo)物質(zhì)的供試品溶液,注入儀�,記錄色譜圖,測量供試品(或其雜�(zhì))峰和內(nèi)�(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰�,按下式計算含量:Ax含量(mx)=f×-As/ms式中Ax為供試品(或其雜�(zhì))峰面積或峰高;mx為供試品(或其雜�(zhì))的�。f、As和ms的意義同��
  �(dāng)配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)�(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一分內(nèi)�(biāo)物質(zhì)溶液�,則配制�(nèi)�(biāo)物質(zhì)溶液不必精密稱(量)取�
  外標(biāo)法 測定供試品中含量
  按各品種�(xiàng)下的�(guī)�,精密稱(量)取對照品和供試�,配制成溶液,分別精密取一定量,注入儀�,記錄色譜圖,測量對照品和供試品待測成分的峰面積(或峰高),按下式計算含量:
  A<[x]>含量(mx)=mr×-Ar式中各符號意義同�
  由于微量注射器不易精確控制�(jìn)樣量,當(dāng)采用外標(biāo)法測定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量�,以定量�(huán)�(jìn)樣為��
  綜述
  要正確地選擇色譜分離方法,首先必須盡可能多的了解樣品的有�(guān)性質(zhì),其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其�(yīng)用范�。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對分子�(zhì)量的大小,在水中和有�(jī)溶劑中的溶解�,極性和�(wěn)定程度以及化�(xué)�(jié)�(gòu)等物�、化�(xué)性質(zhì)�
  相對分子�(zhì)�
  對于相對分子�(zhì)量較低(一般在200以下�,揮�(fā)性比較好,加熱又不易分解的樣�,可以選擇氣相色譜法�(jìn)行分析。相對分子質(zhì)量在200~2000的化合物,可用液固吸�、液-液分配和離子交換色譜�。相對分子質(zhì)量高�2000,則可用空間排阻色譜��
  溶解�
  水溶性樣品用離子交換色譜法和液液分配色譜�;微溶于�,但在酸或堿存在下能很好電離的化合物,也可用離子交換色譜�;油溶性樣品或相對非極性的混合�,可用液-固色譜法�
  化學(xué)�(jié)�(gòu)
  若樣品中包含離子型或可離子化的化合物,或者能與離子型化合物相互作用的化合物(例如配位體及有機(jī)螯合劑),可首先考慮用離子交換色�,但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于離子化合�;異�(gòu)體的分離可用液固色譜法;具有不同官能�(tuán)的化合物、同系物可用液液分配色譜法;對于高分子聚合物,可用空間排阻色譜法�

�(shè)�

  綜述
  HPLC的出�(xiàn)不過三十多年的時�,但這種分離分析技�(shù)的發(fā)展十分迅�,應(yīng)用十分廣泛。其儀器結(jié)�(gòu)和流程多種多�。典型的高效液相色譜儀�(jié)�(gòu)和流程可用下列方框圖表示(SeeFig.3-4)。高效液相色譜儀一般都具備貯液�、高壓泵、梯度洗提裝置(用雙泵)、�(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部��
  高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點(diǎn)、熱�(wěn)定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物�(zhì),因而廣泛應(yīng)用于核酸、肽�、內(nèi)�、稠�(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)�、表面活性劑,抗氧化�、殺蟲劑、除莠劑的分析等物質(zhì)的分析�
  高壓�
  HPLC使用的色譜柱是很�(xì)�(1~6mm),所用固定相的粒度也非常?。◣爪蘭到幾十μm),所以流動相在柱中流動受到的阻力很大,在常壓下,流動相流速十分緩�,柱效低且費(fèi)�。為了達(dá)到快速、高效分�,必須給流動相施加很大的壓力,以加快其在柱中的流動速度。為此,須用高壓泵�(jìn)行高壓輸�。高�、高速是高效液相色譜的特�(diǎn)之一。HPLC使用的高壓泵�(yīng)滿足下列條件�
  a.流量恒定,無脈動,并有較大的�(diào)節(jié)范圍(一般為1~10mL/min)�
  b.能抗溶劑腐蝕�
  c.有較高的輸液壓力;對一般分��60×10^5Pa的壓力就滿足了,對高效分�,要求達(dá)�150~300×10^5Pa�
 ?、磐�?fù)式柱塞泵
  �(dāng)柱塞推入缸體�,泵頭出口(上部)的單向閥打開,同時,流動相�(jìn)入的單向閥(下部)關(guān)閉,這時就輸出少量的流體。反�,當(dāng)柱塞向外拉時,流動相入口的單向閥打開,出口的單向閥同時關(guān)�,一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體�。這種泵的特點(diǎn)是不受整個色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影�,連續(xù)供給恒定體積的流動相�
 ?、茪鈩臃糯蟊?BR>  其工作原理是:壓力為p1的低壓氣體推動大面積(SA)活塞A,則在小面積(SB)活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于A和B兩活塞的面積�,如果A與B的面積之比為50:1,則壓力�5×Pa的氣體就可得到壓力為250×Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵�
  梯度洗脫
  類似于GC中的程序升溫。已成為�(xiàn)代高效液相色譜中不可缺少的部��
  氣動放大�
  梯度洗提,就是載液中含有兩種(或更多)不同極性的溶劑,在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性,通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因�,以提高分離效果。梯度洗提可以分為兩種:
  a.低壓梯度(也叫外梯度):在常壓下,預(yù)先按一定程�?qū)煞N或多種不同極性的溶劑混合�,再用一臺高壓泵輸入色譜柱�
  b.高壓梯度(或稱�(nèi)梯度系統(tǒng)):利用兩臺高壓輸液泵,將兩種不同極性的溶劑按設(shè)定的比例送入梯度混合室,混合�,�(jìn)入色譜柱�
  �(jìn)樣裝�
 ?、抛⑸淦鬟M(jìn)樣裝置:�(jìn)樣所用微量注射器及�(jìn)樣方式與GC法一�。�(jìn)樣壓�150×10^5Pa時,必須采用停流�(jìn)樣。⑵高壓定量�(jìn)樣閥:與GC法用的流通法相似,能在高壓下�(jìn)��
  色譜�
  色譜柱是色譜儀最重要的部件(心臟�。通常用厚壁玻璃管或內(nèi)壁拋光的不銹鋼管制作的,對于一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時,可用銅�、鋁管或聚四氟乙烯管。柱子內(nèi)徑一般為1�6mm。常用的�(biāo)�(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為4.6�3.9mm,長度為15�30cm的直形不銹鋼�。填料顆粒度5�10μm,柱效以理論塔板�(shù)計大�7000�10000�
  �(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效�
  檢測�
 ?、抛贤夤舛葯z測器
  它的作用原理是基于被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收,組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比爾定�。最常用的檢測器,應(yīng)用最廣,對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)�
  特點(diǎn)�
  a.靈敏度高:其最小檢測量10-9g·mL-1,故即使對紫外光吸收很弱的物質(zhì),也可以檢測�
  b.線性范圍寬;(比爾定律�
  c.流通池可做的很�(1mm×10mm,容�8μL)�
  d.對流動相的流速和溫度變化不敏感可用于梯度洗脫�
  e.波長可選,易于操作:�,使用裝有流通池的可見紫外分光光度計(可變波長檢測器��
  缺點(diǎn):對紫外光完全不吸收的試樣不能檢�;同時溶劑的選擇受到限制�
 ?、乒怆姸O管陣列檢測器
  紫外檢測器的重要�(jìn)展;陣列�1024個光電二極管陣列,每個光電二極管寬僅50μm,各檢測一窄段波長。如圖所示,在檢測器�,光源發(fā)出的紫外或可見光通過液相色譜流通池,在此流動相中的各個組分�(jìn)行特征吸�,然后通過狹縫,�(jìn)入單色其�(jìn)行分�,由光電二極管陣列檢�,得到各個組分的吸收信號。經(jīng)計算�(jī)快速處�,得三維立體譜圖�
 ?、菬晒鈾z測器
  熒光檢測器是一種高靈敏�、高選擇性檢測器�
  對多�(huán)芳烴,維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合�、農(nóng)藥、藥�、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)�
  熒光檢測器的�(jié)�(gòu)及工作原理和熒光光度計相��
 ?、炔钍菊酃鈾z測器
  除紫外檢測器之外�(yīng)用最多的檢測��
  差示折光檢測器是借連續(xù)測定流通池中溶液折射率的方法來測定試樣濃度的檢測器。溶液的折射率是�?nèi)軇鲃酉啵┖图�(nèi)苜|(zhì)(試樣)折射率乘以各物質(zhì)的濃度之�。因此溶有試樣的流動相和純流動相之間折射率之差表示試樣在流動相中的濃度�
 ?、呻�?dǎo)檢測�
  其作用原理是根據(jù)物質(zhì)在某些介�(zhì)中電離后所�(chǎn)生電�(dǎo)變化來測定電離物�(zhì)含量�

正反色譜

  正相色譜�
  采用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相);流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已�、環(huán)已烷),常加入乙�、異丙醇、四氫呋�、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較�(qiáng)的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等��
  反相色譜�
  一般用非極性固定相(如C18、C8);流動相為水或緩沖液,常加入甲醇、乙�、異丙醇、丙�、四氫呋喃等與水互溶的有�(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合�。RPC在現(xiàn)代液相色譜中�(yīng)用最為廣泛,�(jù)�(tǒng)�,它占整個HPLC�(yīng)用的80%左右�

�(shí)�

  高效液相色譜�,只要求試樣能制成溶液,而不需�?dú)�?,因此不受試樣揮�(fā)性的限制。對于高沸點(diǎn)、熱�(wěn)定性差、相對分子量大(大于400以上)的有機(jī)物(這些物質(zhì)幾乎占有�(jī)物總�(shù)�75%�80%)原則上都可�(yīng)用高效液相色譜法來�(jìn)行分�、分析。據(jù)�(tǒng)�,在已知化合物中,能用氣相色譜分析的約占20%,而能用液相色譜分析的約占70�80%�
  1、環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析
  固定相:薄殼型硅�(37�50mm)
  流動相:正己�
  流速:1.5mL/min
  色譜柱:50cm&acute�2.5mm(內(nèi)徑)
  檢測器:差示折光檢測�
  可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量�(jìn)行分析�
  2、稠�(huán)芳烴的分�
  稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)�
  固定相:十八烷基硅烷化鍵合相
  流動相:20%甲醇-水~100%甲醇;線性梯度淋�2%/min
  流速:1mL/min
  柱溫�50�
  柱壓�70&acute;104Pa
  檢測器:紫外檢測�
  3.陰離子分析
  雙柱;薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm),
  流動相:0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3,流�138mL/hr�
  七種陰離子在20分鐘�(nèi)基本上得到完全分�,各組分含量�3�50ppm�

維庫電子�,電子知識,一查百��

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