實時定量PCR是檢測基因表�(dá)最靈敏、最可靠的方�,但由于實時定量PCR需要制備標(biāo)�(zhǔn)曲線和同時分析內(nèi)參基�,因而每次實驗只能檢測少�(shù)幾個基因的表達(dá)水平,若要檢測大量基�,則工作量巨�,耗時長久。經(jīng)過對實時定量PCR體系�(jìn)行優(yōu)化開�(fā)出的PCR芯片,可同時�(jìn)行多種基因的研究,并且還可節(jié)省在�(shù)�(jù)分析方面所花費(fèi)的時�,使研究者可以在更短的時間內(nèi)得到更豐富的信息,PCR芯片可廣泛用于生命科�(xué)、生物技�(shù)、疾病檢�、臨床醫(yī)�(xué)和環(huán)境檢測等�(lǐng)域,是近年生命科�(xué)�(lǐng)域常用的研究手段之一�
采用PCR芯片�(jìn)行實驗只需2小時。PCR芯片實驗過程:首先將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA鏈,作為PCR模板;接�,將模板加入到反�(yīng)體系(RT2 Real-TimeTM SYBR Green PCR Master Mix)中。在已經(jīng)固定好基因特異性引物的96孔板各孔�,加入等量的PCR反應(yīng)體系,�(jìn)行PCR反應(yīng)。采用儀器配套的軟件計算PCR芯片中的每個基因的循環(huán)閾值(Ct��,采用△△Ct方法比較對應(yīng)的兩個樣本中同一基因的表�(dá)量變化。通過分析看家基因Ct值的一致�,可確定合適的標(biāo)�(zhǔn)化方法。芯片所�(shè)置的對照,可以檢測PCR體系中是否存在DNA污染,或者是否有影響反轉(zhuǎn)錄或PCR實驗步驟的因素存��
采用PCR芯片開展研究,技�(shù)上的難點(diǎn)是如何在同一次實驗中,相同的PCR反應(yīng)條件下保證不同的基因有相近的�(kuò)增效�,并且獲得與單個基�?qū)崟r定量PCR反應(yīng)相當(dāng)?shù)撵`敏度,特異性和可重�(fù)�。因此首先設(shè)計篩選出的候選引物,接著通過實驗,在不同反應(yīng)條件�,檢測PCR反應(yīng)體系與幾千條PCR引物的組合,最終獲得了�(yōu)化的引物和PCR反應(yīng)體系,適�(yīng)PCR芯片的要��
根據(jù)一次實驗所檢測樣品�(shù)量的多少,可將PCR芯片分為低通量和高通量PCR芯片�
低通量PCR芯片的載體為96孔或384孔PCR反應(yīng)�,僅須將制備好的樣品cDNA加入相應(yīng)的反�(yīng)孔內(nèi),在熒光定量PCR儀上�(jìn)行擴(kuò)增即�。在靈敏度方�,每次擴(kuò)增僅需400ng總RNA。但低通量PCR芯片所檢測的基因數(shù)量有�,而且無法�(jìn)行多個樣品的多個基因的并行檢測。低通量PCR芯片使用時和通常的定量PCR操作步驟相同,即從待檢的生物樣品(細(xì)�、組織、血液等)中提取總RNA或分離出mRNA→經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA→將所得的cDNA直接等量加入含有相應(yīng)待檢測基因引物的孔中→加入PCRmix→在熒光定量PCR儀上�(jìn)行PCR定量檢測→數(shù)�(jù)分析�
高通量PCR芯片是在固相載體上固定有成百上千個基因的特異性引物,并且可同時檢測高�(dá)成百上千個樣�,達(dá)到同時并行檢測多個樣品的多個基因表�(dá)的能力。因�,具有檢測通量�、耗時短和樣品用量少的�(yōu)�(diǎn)。由AppliedBiosystems公司研制的OpenArraySystem和Fluidigm公司開發(fā)的BioMarkSystem將熒光定量PCR技�(shù)與高通量芯片技�(shù)相結(jié)�,屬于高通量PCR芯片,但這些芯片必須在特定的定量PCR儀器上使用�(jìn)��
PCR芯片與常�(guī)PCR相比�
1、整體性:PCR芯片操作系統(tǒng)采用多基因擴(kuò)�、結(jié)果分析一體化,操作簡�;傳�(tǒng)的PCR采用單基因擴(kuò)增及�(jié)果分�,操作繁��
2、時�:PCR芯片檢測多個基因的時間是過去PCR檢測單個基因的時間�
3、試�:傳統(tǒng)PCR對試劑用量有要求�15微升以下就很難得到理想的�(kuò)增結(jié)�,PCR芯片可以�(kuò)�10微升以下的樣品,這相�(yīng)減少了試劑如Taq酶的用量,節(jié)省了實驗�(jīng)�(fèi)也減少了廢液污染。因�,與常規(guī)的PCR�(kuò)增技�(shù)相比,PCR芯片具有反應(yīng)體積�、反�(yīng)速度快、操作簡�、價格低、樣品用量少、無污染、節(jié)省試驗成�、便于集成化、結(jié)果可靠的�(yōu)�(diǎn)�
使用PCR芯片技�(shù)�(jìn)行基因表�(dá)(信號通路或多個相�(guān)基因)的檢測,已普遍用于生命科學(xué)研究的多個領(lǐng)�,如疾病�(fā)病機(jī)制研究,為研究結(jié)腸癌的程序性死亡(包括�(xì)胞凋亡和自噬)狀�(tài),Chang等應(yīng)用PCR芯片同時檢測癌癥組織和正常組織中與細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)�22個基因的表達(dá)情況,發(fā)�(xiàn)腫瘤組織的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA表達(dá)水平是正常組織的4.01�,而與程序性死亡和自噬相關(guān)的多個基�,包括腫瘤壞死因子受體(TNFR�、BCL2相關(guān)蛋白(Bax)、半胱天冬酶9(CASP9�、半胱天冬酶3(CASP3)及損傷控制的自噬調(diào)節(jié)子(DRAM)和抗紫外線相關(guān)基因(UVRAG)表�(dá)下調(diào),說明腫瘤組織的代謝活性增加而凋亡速率降低,這可能是腫瘤組織增殖旺盛的原��
Karén等運(yùn)用人類血管生長相�(guān)基因�96孔板PCR芯片檢測了組蛋白脫乙?;敢种苿┍焖嵩隗w外對人微血管周�(xì)胞的血管發(fā)生作用的影響。結(jié)果表明,�(jīng)丙戊酸處理后,人微血管周�(xì)胞中有涉及內(nèi)皮細(xì)胞存活的血管生成素�4(ANGPTL4)和白介�-8(IL-8�、內(nèi)皮細(xì)胞管成熟與穩(wěn)定的成纖維細(xì)胞生長因子受�3(FGFR3)等14個基因表�(dá)改變,這些變化均可促�(jìn)血管的�(wěn)定與成熟。提示PCR芯片作為一種快�、準(zhǔn)確的技�(shù)手段,可�(yīng)用于藥物�(jī)理研究中�
在食品安全檢測中,李永新等建立了食品中沙門菌和單增李斯特菌的多重PCR-芯片電泳快速檢測方法。根�(jù)沙門菌和單增李斯特菌的特征基因合�2對特異性引�,優(yōu)化聚合酶鏈反�(yīng)(PCR)體系,采用芯片毛�(xì)管電泳快速檢測食品中上述2種致病菌的多重PCR�(kuò)增產(chǎn)�。在�(yōu)化的實驗條件��6min�(nèi)即可完成沙門菌和單增李斯特菌的同時檢�;遷移時間的日內(nèi)精密度為0.20%�1.7%,日間精密度3.7%�4.5%�