液相色譜儀由高壓輸液泵、�(jìn)樣系�(tǒng)、溫度控制系�(tǒng)等組�,是利用混合物在�-固或不互溶的兩種液體之間分配比的差異,對混合物�(jìn)行先分離,而后分析鑒定的儀�。日常工作中,液相色譜儀的保�(yǎng)非常重要,注意不要讓空氣�(jìn)入輸液系�(tǒng)和高壓泵中,儲液器內(nèi)的溶液如長時間未用應(yīng)清洗儲液器并更換溶液,每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,防止無�(jī)鹽析出或沉積�
液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體,又分為�-液色�(LLC)及液-固色�(LSC)。現(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、�(jìn)樣系�(tǒng)、溫度控制系�(tǒng)、色譜柱、檢測器、信號記錄系�(tǒng)等部分組�。與�(jīng)典液相柱色譜裝置比較,具有高效、快�、靈敏等特點�
1、吸附柱色譜�
2、分配柱色譜�
3、離子交換柱色譜�
4、凝膠柱色譜�
系統(tǒng)由儲液器、泵、�(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系�(tǒng),樣品溶液經(jīng)�(jìn)樣器�(jìn)入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系�(shù),在兩相中作相對�(yùn)動時,經(jīng)過反�(fù)多次的吸�-解吸的分配過�,各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測器時,樣品濃度被�(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)�(jù)以圖譜形式打印出來高效液相色譜儀主要有�(jìn)樣系�(tǒng)、輸液系�(tǒng)、分離系�(tǒng)、檢測系�(tǒng)和數(shù)�(jù)處理系統(tǒng),下面將分別敘述其各自的組成與特��
�(jìn)樣系�(tǒng)
一般采用隔膜注射�(jìn)樣器或高壓�(jìn)樣間完成�(jìn)樣操作,�(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重�(fù)性是有益��
輸液系統(tǒng)
該系�(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部�。高壓泵的一般壓�(qiáng)為l�47�4�4X10Pa,流速可�(diào)且穩(wěn)�,當(dāng)高壓流動相通過層析柱時,可降低樣品在柱中的�(kuò)散效�(yīng),可加快其在柱中的移動速度,這對提高分辨�、回收樣�、保持樣品的生物活性等都是有利�。流動相貯存器和梯度儀,可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改�,包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)�、PH值,或改用競爭性抑制劑或變性劑�。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個基�(tuán)的差別或是同分異�(gòu)體)都能獲得有效分離�
分離系統(tǒng)
該系�(tǒng)包括色譜�、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10�50cm(需要兩根連用�,可在二者之間加一連接管),內(nèi)徑為2�5mm,由"�(yōu)�(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,住�(nèi)裝有直徑�5�10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液�(gòu)成).固定相中的基質(zhì)是由�(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠�(gòu)成,它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點,加之其表面�(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣),或者用化學(xué)法偶�(lián)各種基因(如磷酸�、季胺基、羥甲基、苯�、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有�(jī)化合�。因�,這類固定相對�(jié)�(gòu)不同的物�(zhì)有良好的選擇�。例�,在多孔性硅膠表面偶�(lián)豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維�(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來�
另外,固定相基質(zhì)粒小,柱床極易達(dá)到均�、致密狀�(tài),極易降低渦流擴(kuò)散效�(yīng)。基�(zhì)粒度�,微孔淺,樣品在微孔區(qū)�(nèi)傳質(zhì)�。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根�(jù)柱效理論分析,基�(zhì)粒度�,塔板理論數(shù)N就越�。這也�(jìn)一步證明基�(zhì)粒度小,會提高分辨率的道��
再�,高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫�(diào)�60C,通過改善傳質(zhì)速度,縮短分析時�,就可增加層析柱的效��
液相色譜儀對高沸點、難氣化合物的混合物通過色譜柱核淋洗劑并以實�(xiàn)分離�
液相色譜儀使用范圍/液相色譜儀 編輯
�(yīng)用于生物�(yī)�(xué)、環(huán)境化�(xué)、石油化工等部門�
高效液相色譜法只要求樣品能制成溶�,不受樣品揮�(fā)性的限制,流動相可選擇的范圍�,固定相的種類繁�,因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮�(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物�(zhì)。與試樣�(yù)處理技�(shù)相配�,HPLC所�(dá)到的高分辨率和高靈敏�,使分離和同時測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能,能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)�,有可能在充分保持生化物�(zhì)活性的條件下完成其分離HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏�、速度快、色譜柱可反�(fù)利用,流出組分易收集等優(yōu)�,因而被廣泛�(yīng)用到生物化學(xué)、食品分�、醫(yī)藥研�、環(huán)境分�、無�(jī)分析等各種領(lǐng)�。高效液相色譜儀與結(jié)�(gòu)儀器的�(lián)用是一個重要的�(fā)展方向。液相色�-�(zhì)譜連用技�(shù)受到普遍重視,如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等;液相色譜-紅外光譜連用也發(fā)展很快如在環(huán)境污染分析測定水中的烴類,海水中的不揮發(fā)烴類,使�(huán)境污染分析得到新的發(fā)��
1、液相色譜柱的結(jié)�(gòu):a、空柱由柱接�、柱管及濾片組裝而成。柱接頭采用低死體積�(jié)�(gòu),柱接頭是兩端螺紋組�,一端是�7/16英寸外螺�,另一端是3/16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已�(guī)范化)�7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接,中間放置壓壞用于密��3/16英寸的內(nèi)螺紋�1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接,中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積,在安裝色譜柱時,用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到�,然后再擰緊空心螺釘。壓�(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)�(yán)格控制在2�5mm長或其他固定尺寸)。在兩端柱接頭內(nèi),柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾�(wǎng)),用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流�??罩鹘M件均�316#不銹鋼材�(zhì),能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時要注�,柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑,以避免腐�。b、柱填料� 液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間�(jìn)行的,柱子的分類是依�(jù)填料類型而定。正相柱:多以硅膠為柱填�。根�(jù)外型可分為無定型和球型兩�,其顆粒直徑�3�10 ?m的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN�-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。反相柱:主要是以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填�。也有無定型和球型之分。常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等,其顆粒粒徑�3�10 ?m之間�2、色譜柱的安裝:a、拆開柱包裝�,確�(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱�(nèi)貯存的溶�。b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備�。c� 按柱管上�(biāo)示的流動相流�,將色譜柱的入口端通過連接管與�(jìn)樣閥出口相連接(如條件允許,建議在柱前使用保�(hù)�);柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑�1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時一定要�(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓�(huán)后盡量用力插到底,然后順時針擰緊空心螺釘,直到擰不動為止,再用扳手繼�(xù)順時針擰1/4-1/2圈,切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現(xiàn)�,請用扳手繼�(xù)順時針擰1/4�,直至不漏液為止�
氣泡溢出
流動相內(nèi)有氣�,關(guān)閉泵,打開泄壓閥,打開purg�,清洗脫氣,氣泡不斷從過濾器冒出,�(jìn)入流動相,無論打開purge鍵幾次,都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液�(nèi),過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖,形成菌�(tuán),阻塞了過濾器,緩沖液難以流暢地通過過濾�,空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器�(jìn)入流動相。處理過濾器浸泡�5%硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即�;亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液�12�36小時,輕輕震蕩幾�,再將過濾器用純水清洗幾�,打開泄壓閥,打開purge鍵清洗脫�,如仍有氣泡不斷從過濾器冒出,繼�(xù)將過濾器浸泡�5%硝酸溶液中,如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出,說明過濾器�(nèi)部的霉菌菌團(tuán)已被硝酸破壞,流動相可以流暢地通過過濾�。打開泄壓閥,打開泵,流速調(diào)�1.0�3.0ml/min,純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗干�。關(guān)閉泄壓閥,純甲醇沖洗半小時即��
柱壓�
⑴緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi)�
⑵樣品污染沉��
處理對于種情況先�40�50℃的純水,低速正向沖洗柱�,待柱壓逐漸下降后,相應(yīng)提高流速沖�,柱壓大幅度下降�,用常溫純水沖洗,之后用純甲醇沖洗柱�30分鐘;對于第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18�,和純水反向沖洗柱子,換成甲醇沖�,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱�,再用換成甲醇沖洗,然后用純水沖�,甲醇沖洗正向沖洗柱�30分鐘以上�
無指�
?、疟妹芊鈮|圈磨損;
?、拼罅繗馀葸M(jìn)入泵體�
處理對于種情�,更換密封墊�;對于第二種情況,在泵作用的同時,用一�50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空��
不穩(wěn)�
原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異�,使得兩者不能密�。處理工作中注意觀察流動相的量,保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶�,避免吸入空�,流動相要充分脫�。如為單向閥和閥座之間夾有異�,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗�
峰分�
?、派V柱被污染�
?、浦^填料塌陷�
處理對于種情�,先用純水反向沖洗柱�,然后換成甲醇沖洗,接著用甲�+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定�,再換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,甲醇沖洗正向沖洗柱�30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不�,則考慮第二種情�。對于第二種情況,擰開柱�,檢查柱填料是否硬結(jié)或塌�。去除硬�(jié)部分(污染的填料),裝入新填�,滴一滴甲�,填料下�,再填,用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓�,再填平,滴甲醇,再壓緊反復(fù)幾次,直至裝滿填�。柱頭用甲醇沖洗干凈,擦凈柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖�30分鐘以上�
重復(fù)性差
⑴�(jìn)樣閥漏液�
⑵加樣針不到��
⑶液量不��
處理對于種情況更換�(jìn)樣閥墊圈;對于第二種情況保證加樣針插到底,注射樣品溶液后須快�、平�(wěn)地從LOAD狀�(tài)�(zhuǎn)換到INJECT狀�(tài),以保證�(jìn)樣量的準(zhǔn)確。日常工作中,液相色譜儀的保�(yǎng)非常重要,注意不要讓空氣�(jìn)入輸液系�(tǒng)和高壓泵�,儲液器�(nèi)的溶液如長時間未用應(yīng)清洗儲液器并更換溶液,每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,防止無�(jī)鹽析出或沉積;樣品的前處理也很重�,任何樣品都要盡可能地去除雜�(zhì),完全溶�,盡量減少對色譜柱的污染,以延長色譜柱的使用壽命,同時避免注射過濃的樣品溶液,以免殘留液在�(jìn)樣閥�(nèi)析出固體引起堵塞;色譜柱作好�(biāo)�,用于不同分析目的的色譜柱不要混用等�
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